[기기분석] HPLC를 이용한 VitaminC의 정량

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[기기분석] HPLC를 이용한 VitaminC의 정량에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

레모나 0.5g을 가해 녹여주었다.
이렇게 준비한 시료들을 여과의 한 방법인 원심분리를 이용하여 상등액만 취해주었다. 오렌지 착즙의 경우 상등액이 85ml, 균질화의 경우 25ml로 측정되었다. 브로콜리 착즙의 경우에는 상등액이 73ml, 균질화의 경우 17ml이었고 레모나는 똑같이 25ml로 측정되었다.
이동상인 용매는 극성용매와 비극성용매를 준비해주었는데, 용매를 제조하는 과정에서 각각 물질의 여과능이 다르기 때문에 각자 여과를 한 후 혼합해주었다. 용매는 순도가 높은 HPLC grade를 사용하여야 하는데, 그 이유는 작은 차이로도 실험에 오차가 크게 생기기 때문이다. 또한 filtration과 sonication을 하여 탈기를 해주어야 오차를 더 줄일 수 있다.
standard 분석방법으로는 외부표준법(external standard method)을 이용하였는데, 표준물질에 대해서 같은 분석조작을 가하여 측정치를 구하고 시료의 측정치와 비교함으로써 정량하는 방법이다. 분석하려는 물질의 표준용액을 농도별로 만들어 각각의 표준용액에 대한 크로마토그램을 얻어 표준용액의 농도와 피크의 면적과의 상관관계를 그린 검량선을 작성하여 미지 물질의 면적에 대응하는 농도를 구해 실험한 용액의 농도를 산출하게 된다. 이 때 쓰이는 외부 표준물질로 비타민 C를 준비해주었다. 800ppm의 농도로 제조하고 400ppm, 100ppm으로 단계희석을 진행해주었다.
용매와 시료가 다 준비된 다음 syringe와 여과의 역할을 하는 syringe filter를 이용하여 바이얄에 넣어주었다. HPLC system에 조건을 입력하고 컬럼을 안정화시키기 위해 buffer용액을 계속 흘려주었는데 이는 컬럼 오염 물질과 막힌 입자를 제거하는 역할을 한다. 컬럼이 안정화되고 압력이 적당히 높아졌을 때 분석을 진행시켜주는데, 우리가 이용한 컬럼은 Alltima HP C18 AQ 컬럼으로 역상컬럼이다. 보통 비타민 C의 분석에는 약산의 분리에 유리한 ion exclusion column을 분리에 사용한다. 역상컬럼은 silica 표면에 C18과 같은 비극성 작용기를 결합시킨 비극성 컬럼으로 이동상으로는 극성용매를 이용하기 때문에 역상컬럼을 이용하게 되면 극성인 물질이 가장 빨리 나오고 비극성인 물질이 늦게 용출된다. 이동상에 물의 비율을 높여 극성도를 증가시킨다면 비극성 시료는 컬럼에 더 오래 머무르고 늦게 나오려 하므로 전체적인 분석시간이 길어지게 된다.
용매를 조성하는 방법에는 시작부터 끝까지 용매의 농도 또는 조성을 일정하게 유지하여 용리하는 방식인 isocratic과 이동상의 조성을 연속적으로 변화시키면서 용리하는 방법인 gradient가 있는데, 우리는 극성과 비극성의 용매를 사용하는 gradient 방법을 이용하여 극성인 시료를 먼저 용출시킬 수 있는 극성용매를 먼저 주입하고 나중에 비극성의 용매를 주입하여 세척의 역할을 하도록 하였다.
분석이 끝나고 난 뒤 결과보고서를 확인하였는데 먼저 RT값은 전체적으로 3.6분대로 측정되었다. 또한 area(mAU)값을 이용하여 농도별로 STD Curve를 작성하였다. 작성하여 검량선을 그리고 R^2값을 구해주었다. R은 relation의 약자로 상관관계를 뜻하며 1에 가까울수록 상관관계가 큰 것으로 볼 수 있다. 구해준 R^2값의 경우 0.9998로 상관관계가 큰 것을 확인하였다.
STD Curve를 작성한 뒤에 시료의 비타민C 함량을 구해주었다. 보고서에 있는 단위는 ppm과 같으며 환산하여 %값으로 구해주었다. 오렌지의 경우 균질화는 0.019%, 착즙은 0.014%로 측정되었고 브로콜리는 측정되지 않았다. 레모나는 빛을 차단한 경우 11.28%, 빛에 노출시킨 경우 11.15%로 측정되었다.
브로콜리의 함량이 측정되지 않은 이유는
문헌 상 오렌지의 비타민 C 함량은 0.046%이고, 브로콜리는 0.098%이며 레모나는 25%인데 전체적으로 함량이 많이 낮게 측정된 것을 볼 수 있었다. 오렌지와 브로콜리의 경우 실험 전과정에 빛을 차단하고 온도도 낮게 유지해주었기 때문에 함량이 적게 나온 이유는 시료를 전처리할 때의 회수율과 관련이 있을 것으로 생각된다. 상등액의 양과 실제 시료의 수분함량을 바탕으로 수율을 측정해주었을 때 먼저 오렌지의 일반적인 수분함량은 85%인데, 착즙의 경우 회수율이 72%이고 균질화의 경우 회수율이 85%였다. 브로콜리의 일반적인 수분함량은 90% 이상으로, 착즙의 경우 회수율이 61%, 균질화의 경우 회수율이 57%였다. 이와 같이 모든 시료가 적게는 15%에서 많게는 42%까지의 손실이 있었다. 따라서 비타민 C의 함량이 낮게 측정되었을 것으로 예상된다. 레모나의 경우 오렌지와 브로콜리 보다는 오차가 크지 않았으나 균질화를 시켜주었기 때문에 균질화할 때 발생한 열에 의해 파괴되었을 것으로 생각된다.
다음으로는 전처리의 방법에 따라 비교해주었다. 브로콜리의 경우 값이 측정되지 않아서 비교할 수 없었고 오렌지의 경우 착즙과 균질화를 비교해보았는데 균질화한 경우 열로 인해 파괴되어 더 낮게 측정될 것으로 예상했으나 착즙한 경우의 함량이 더 높게 측정되었다. 이는 균질화과정에서 영향이 없었던 것이 아니라, 착즙의 경우에는 과즙만 이용하고 균질화는 어느정도의 고형분을 포함하는데 아마 오렌지의 고형분에 비타민 C가 더 많이 함유되어서 일것으로 생각된다.
레모나의 빛에 노출시킨 경우와 빛을 차단한 경우를 비교하였을 때는 예상대로 빛에 노출시킨 경우의 비타민 C 함량이 더 낮게 측정되어, 빛과 온도가 영향을 주었음을 알 수 있었다.
전체적으로 피크 모양을 관찰한 결과 레모나에 피크가 가장 적어 시료 중 가장 순수한 물질임을 추측할 수 있었고, 오렌지에 피크가 가장 많아 여러 물질이 혼합되어 있음을 알 수 있었다. 또한 레모나의 경우에는 이상이 없었지만 브로콜리와 오렌지의 베이스라인의 경우 기울어진 것으로 보아 gradient가 용리되었거나 다른 성분의 피크와 함께 용리되어서 일 것으로 보인다.
따라서 우리는 이번 실험을 통해서 HPLC의 원리를 익히고 비타민 C를 정량하며, 결과를 분석하여 오차의 원인을 추측할 수 있었다.

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