PCR 실험 보PCR 실험 보고서고서

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목차

(1)실험제목
(2)실험 재료
(3)실험 목표
(4)실험 방법
(가)해부
(나)RNA 추출
(다)RNA 농도측정
(라)cDNA 합성
(마)PCR
(바)전기 영동
(사)Gel Purification
(아)Ligation
(자)Transformation
(차)Pick up
(카)집균
(타)효소 처리
(5)실험 결과
(6)고찰

본문내용

size에 걸린 DNA밴드를 면도칼로 잘라 tube에 보관한다.
전기영동이 완성된 모습
(사)Gel purification
A. 겔 무게 구하기 : (겔이 든 무게) - (빈 튜브무게) = 겔의 무게
B. 겔 무게 * 3배 = GB buffer
GB buffer : 겔을 녹이는 용액이다
C. water bath 50\'C에서 10분간 겔을 녹인다.(1~2분하고, vortex)
D.켈 무게만큼 iso-propanol 첨가
*iso-propanol : DNA와 결합하여 응축시키는 역할을 한다.
E. invert조금 후 살짝 vortex, spindown
F.spincolum에 옮김
G.원심분리 1분 (1000g)
H.하층액을 버리고 NW buffer 750㎕
*NW buffer : DNA를 세척하는 시약이다.
I. 실온 5분간 방치
J. 원심분리 1분 (1000g)
K. 하층액을 버리고 원심분리 1분(1000g)
L. spincolum을 1.5ml에 옮긴다.
M. EB buffer 30㎕
*EB buffer : 세척이 끝난 DNA를 녹여내는 시약이다.
N.실온에 1분간 방치후 원심분리 1분
O.spincolum제거
(아)Ligation
*DNA를 Vector에 삽입하는 과정(Recombinent DNA)
ligase buffer 2.5㎕
+vector 0.5㎕
+ligase 0.5㎕
+DNA 2㎕
실온에서 1시간 반응
(자)Transformation
DNA를 대장균 내로 주입하는과정
A. 대장균 20㎕ + Ligation된 DNA 5㎕
B. 가볍게 vortex(1초)
C. on ice 9분
D. 고체배지에 도말
E. 37‘C incubator에서 overnight으로 반응
고체배지에 도말
(차)Pick up
A. 액체배지 2.7ml을 15ml 튜브에 분주
B. Ampicilin 2.7㎕를 튜브 끝에 넣고, 기울여 액체 배지와 섞는다.
*Ampicilin(항생제)는 우리가 원하는 대장균(Plasmid를 가진 대장균)을 selection할 수있도록 해준다.(Plasmid를 가지지 않은 대장균 colony형성 불가)
C. 이쑤시개로 white colony를 찍어, 보관할 고체배지에 찍은후
*다시 보관할 고체배지에 대장균을 찍어주는데, 배양한 세균을 보관할 목적과, 액체배지의 균이 우리가 원하는 균이 맞는지 확인할 목적으로 다시 찍어준다.
*X-gal처리(Lac Z유전자가 끊어진 재조합 DNA를 가진 대장균은 white colony 형성)
(Lac Z유전자가 정상인 대장균은 blue colony 형성)
D. 액체배지가 담긴 15ml 튜브에 이쑤시개 끝을 널고 흔들어 섞는다.
*공기와 섞어주며 세균들이 대사할 수 있도록
E. tube를 shaking incubator에서 overnight으로 반응 (37‘C, 200rpm)
*세균이 배양되면서 투명했던 액체 배지는, 뿌옇게 변한다.
표시해놓은부분(white colony)이 Plasmid에 DNA가 들어간 세균
white colony 부분의 세균을 픽업
ㅊ
세균이 배양되는 과정
뿌옆게 세균이 증식한 사진
(카)집균(plasmid DNA purification)
A. 액체배지에 배양된 균을 1.5ml tube에 담은 후 , 원심분리
*세균은 가라앉히기 위함
B.상측액을 버린후. 남은 군을 tube에 마저 담은 후, 원심 분리 1분
C.상층액을 버린후 , 남아있는 액체배지는,kims위에 톡톡 두드려 최대한 제거한다.
D. S1 250㎕ 분주후, 덩어리가 풀어질 때 까지 vortex
*세포벽을 깨줌
E. S2 250㎕분주 후 , inverting 4회
*세포막을 깨줌-파란색으로 변화하게 된다.
F.실온 3분 방치 후 , S3 350㎕분주
*불순물들을 빼내줌(응집)--파란색에서 하얀색으로 변화하게 된다.
G.inverting 5회 후, 원심분리 10분
H.상층액을 spin colume에 옮긴다.(옮길 때 찌꺼기는 들어가지 않게 조심할 것)
*밑에 찌꺼기(대장균의 세포벽,세포막)가 들어가지 않게 한다, 분자량이 가벼운 벡터만 가지고 있다.(+원하는 DNA)
I.원심분리 1분후 , 하층액을 버린다.
J.PW 750 ㎕ 분주
K.원심분리 1분 후, 하층액 버리고 원심분리 1분 더 실시한다.
L.맨 위 필터있는 튜브를 1.5ml 튜브에 옮기고 EB 30 ㎕ 분주
M. 실온 방치 1분 후 원심분리 1분, 위 필터있는 튜브를 버린다.
(타)효소처리
SDW(멸균 3차 증류수) 13㎕
+10x H buffer 2㎕
+EcoR 1 1㎕
+Plasmid DNA 4㎕
37\'C incubator에서 1시간 반응 후
10x loading buffer (2㎕)를 사용하여 전기 영동
5.실험 결과
6.고찰
이번 실험을 통하여 PCR을 통한 Gene cloning을 배웠다.
Gene cloning으로 DNA을 자르고 붙이고 변형시켜서 실험에 필요한 재조합 recombinant DNA을 제조하는데 중심을 둔 실험이었다. 재조합 DNA를 삽입하는 과정을 배우는 도중에 Plasmid의 복제를 하므로써 재조합 DNA가 하는 역할에 대해 더 와닿게 배울 수 있었고, 다른 실험에서 사용한 DNA, 대장균 말고도 다른 DNA와 다른 세균 등을 이용해 볼 수 있지 않을까 하는 생각이 들었다.
이 실험의 가장 키포인트가 되는 것은 PCR이다, 염기 서열의 일부를 알고 있는 경우에는 PCR방법으로 유전자를 증폭 시킬 수 있다. cDNA를 PCR하므로써 cDNA의 PCR의 원리와,각 단계별에 쓰이는 관찰하기 쉽게 쓰이는 효소, 약품들에 대해 알수 있었다. 또한 DNA를 벡터에 삽입하고 배양하여 선별하는 과정을 거쳐 나중에 목적의 recombinent DNA를 얻을 수 있다.
항상 실험에서도 조금이라도 흐트러지게 실험에 임하면 우리가 원하는 실험의 값과 전혀 틀리게 나오게 된다. 손에는 RNA를 분해하는 효소가 있다. 그러므로 손으로 실험기구들을 만지지말며, 반드시 장갑을 착용해서 사용해야한다. 세균을 배양하는 과정에서 우리가 원하는 DNA가 들어가 있는 세균들의 colony들이 그렇게 많지 않은 것을 보면, 더욱 신중을 기해서 몇 일 간 들인 수고를 헛것으로 만들지 않아야 겟다

키워드

전기영동실험,   pcr,   분자생물학실험,   RNA,   DNA