TLC와 HPLC를 통한 당분석

소개글

TLC와 HPLC를 통한 당분석에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Subject
2. Object
3. Principles
(1) 박층 크로마토그래피(thin layer chromatography, TLC)
1) TLC의 원리
2) TLC의 이동상
3) 전개판과 정지상의 종류
4) TLC 실험법과 분석법
5) 성분의 위치 확인법
6) 정성 분석
7) 정량 분석
8) TLC의 응용
(2) 고성능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography, HPLC)
1) HPLC의 구성 및 원리
2) 이동상 저장기
3) 펌프 장치
4) 시료 주입 장치
5) column
6) 검출기
7) HPLC의 영역
4. Procedure
(1) TLC에 의한 당류의 분석
(2) HPLC에 의한 당류의 정성 및 정량 분석
5. Reference

본문내용

야, 많은 다른 과학분야 및 공중위생 분야에서 흔히 다루는 물질에 널리 사용할 수 있기 때문 이다. 이런 물질의 예로는 아미노산, 단백질, 핵산, 탄화수소, 탄수화물, 약품, 테르페노이드, 살충제, 항생제, 스테로이드, 금속-유기 화학종 및 여러 가지 무기물질을 들 수 있다.
4. Procedure
(1) TLC에 의한 당류의 분석
1) TLC판(plate)의 제작
5g의 silica gel G를 50㎖ 삼각플라스크에 취하여 약 11㎖의 증류수를 넣고, 깨끗한 고무마 개를 하여 20초간 흔들어 섞는다. 이것을 현미경용 slide glass의 위를 따라 직경 5∼6㎜의 유리봉을 이용하여 유리 전면에 도포한다. 10∼15분간 방치하여 거의 건조하면 사용한 나일 론 테이프와 종이를 제거하고 110 의 전기로 또는 건조기에서 30분간 건조한다. 이때 도포 한 silica gel의 표면에 흠이 가지 않도록 주의하여야 한다.
2) 시료의 첨가 및 전개
정성실험을 위해서는 0.1∼1%의 시료용액을 사용하여 유리의 모세관 또는 마이크로피펫으 로 박층 위에 점적한다. 조제(시료의 분리정제)의 목적에는 두께 1∼2㎜를 사용하여 많은 양 (5∼200㎎ 정도)을 점적할 수도 있다.
점적을 하는 위치는 TLC plate의 하단으로부터 약 3㎝, 용매면으로부터 약 2㎝ 떨어지도록 한다. Spot의 직경은 될 수 있으면 적게 하고, 0.5㎜ 이내가 되도록 한다.
점적을 한 다음에는 전개용매가 들어있는 유리로 된 밀폐전개조에 넣어서 상승법에 의하여 전개한다. 전개용매의 종류에 따라서 전개속도는 많은 영향을 받는다. 극성이 강한 용매일수 록 전개속도는 빨라진다. 용출력 및 극성은 대체적으로 다음과 같은 순으로 높아진다.
cyclohexane < CCl4 < benzene < CHCl3 < acetone < ethanol < methanol < 물
3) spot의 검출법
보통 전개가 끝난 TLC plate는 용매를 증발시켜 paper chromatography의 검출시약을 분무 하거나 자외선 빛을 이용하는 검출법 또는 autoradiography를 적용시킬 수 있지만, 10∼20% 의 H2SO4 또는 크롬황산을 분무한 다음 100∼200 로 가열하여, 갈색 내지 흙색의 반점으로 써 검출시킬 수도 있다. 이것은 TLC의 특징이다.
<유기화합물에 사용되는 검출시약 >
① 10∼20% H2SO4 : 특급을 사용한다.
② 황산-중크롬산 : Na2Cr2O7 3g을 20㎖의 물에 녹여 10㎖의 진한 H2SO4을 가한다.
③ 요오드의 결정 : 증기로 하여 쪼이면 갈색의 반점으로서 검출된다.
4) Rf값의 측정
반점(spot)의 원점으로부터 전개에 의하여 이동된 반점의 중심까지의 거리(x)와 원점으로부 터 전개용매의 끝까지의 거리(y)를 측정하여 x를 y로 나눈 값을 구한다. 이 값을 보통 시료 화합물의 값이라고 부르지만, 특수한 표현으로서 다음의 값을 사용할 수도 있다.
① 당류 : RG = 시료의 이동거리 / D-glucose의 이동거리
② 핵산염기, nucleoside, nucleotide : R4 = 시료의 이동거리/ adenine(또는 adenosine, 5-A MP)의 이동거리
5) 화합물 반점(spot 또는 band)의 용출
화합물의 보다 정확한 확인, 동정, 불순물 유무의 검정을 위하여 분리된 반점(spot 또는 band)으로부터 화합물을 용출시킬 때도 있다. 주걱(spatula)으로 긁어모으면 목적물의 손실이 많으므로 기구를 유리로 만들어서 진공청소기의 원리를 이용하여 감압하에서 유리관의 끝을 반점에 대하여 목적물을 포함한 흡착제를 깨끗이 긁어모을 수 있으므로 흡착제가 용해되지 않고, 목적물만을 녹이는 용매로 추출한다. 많은 양일 때는 유리솜(glass wool) 대신에 여과 지통을 사용하여 여과지통에 모인 흡착제를 직접 Soxhlet 추출기로 추출할 수 있다.
(2) HPLC에 의한 당류의 정성 및 정량 분석
1) 표준용액의 조제
과당(fructose), 포도당(glucose), 자당(sucrose)의 표준량을 각각 100㎖ 메스플라스크에 정확 히 넣고 증류수 50㎖로 녹인 acetonitrile로 100㎖까지 채운다.
2) 시험용액의 조제
시료 약 5g을 50㎖ 메스플라스크에 정확히 넣고 증류수 25㎖를 가하여 녹인 후 acetonitrile 로 50㎖까지 채운다. 이것을 0.45㎛의 membrane filter로 여과한 것을 시험용액으로 사용한 다.
3) HPLC의 분석조건
column : 길이 300㎜, 내경 4㎜, -Bondapak/Carbohydrate 상당품
검출기 : 자외-가시선(UV-VIS) 검출기
이동상 : water/acetonitrile(17:83)
이동상의 유속 : 1.0㎖/min
column 온도 : 실온
4) 정량
시험용액 및 표준용액을 각각 10㎕씩 주입하여 얻은 peak의 넓이 또는 높이를 구하여 검량 선을 작성한 후 시험용액의 당 농도(㎍/㎖)를 구하고, 다음 식에 의해 시료 중의 당의 함량 (㎎/100g)을 산출한다.
S : 시험용액 중의 당질의 농도(㎍/㎖)
a : 시험용액의 전량(㎖)
d : 희석배수
5. Reference
(1) 기기분석의 원리와 응용. 박면용 외 5인 저. 녹문당. 2000, 375∼379pp, 321∼333pp.
(2) 기기분석(기초와 실험). 정용순 외 3인. 반도출판사. 1997, 513∼524pp.
(3) 대학기기분석. 기기분석교재연구회. 자유아카데미. 2000, 752∼757pp.
(4) 분석화학·기기분석. 최재성. 동화기술. 2000, 392∼399pp.
(5) 식품분석. 김경삼 외 9인 저. 효일문화사. 1999, 50p, 53∼56pp.
(6) 식품분석. 김관우 외 3인 저. 진로연구사. 2002, 58∼61pp.
(7) 식품분석법. 이영근 외 3인 저. 형설출판사. 2000, 47∼49pp, 148p, 149p.
(8) 표준 식품분석학. 채수규 외 5인 저. 지구문화사. 1999, 175∼178pp, 185∼189pp.
(9) 機器分析. 안정수 외 7인 저. 창문각. 2001, 281∼290pp.

키워드

TLC,   HPLC,   크로마토그래피,   당분석,   고성능 액체 크로마토그래피,   박층,   얇은 층