단백질 추출과 전기영동

본문내용

한다. 그리고 SDS-PAGE를 위한 loading 완충용액은 SDS와 β-mercaptoethanol 또는 DTT가 들어있는 SDS-겔 loading 완충용액을 이용한다. 또한 분자량을 알고 있는 단백질을 표시자로 loading하면 시료 단백질의 분자량을 추정해 낼 수 있다.
SDS-PAGE의 또 다른 특징은 불연속 완충용액 시스템(discontinuous buffer system)을 이용한다는 것이다. SDS 겔을 만들 때 각각 다른 pH와 이온 강도의 완충용액을 이용하여 퇴적(stacking)용 겔과 분리(resolving)용 겔을 만들며 런닝 완충용액 또한 다른 pH와 조성을 갖는다.
즉, 시료와 퇴적용 겔은 Tris-Cl (pH 6.8)을 가지며 위쪽과 아래쪽 런닝 완충용액은 Tris-glycine (pH 8.3), 그리고 분리용 겔은 Tris-Cl (pH 8.8)을 갖는다. 이 시스템의 각 성분들은 모두 0.1% SDS를 포함하고 있다. 이 불연속 완충용액 시스템은 퇴적용 겔에서 시료 안의 모든 복합체들을 매우 적은 부피로 농축시켜서 분해용 겔에서 단백질의 해상도를 크게 증가시켜주는 역할을 한다.
그림 12-5. 불연속 완충용액 시스템을 이용한 SDS-PAGE의 원리
시료가 웰(well)에 넣어진 후 전기영동을 시작한다. 단백질이 퇴적용 겔 안에서 농축된다. 단백질들이 분리용 겔에서 분리된다.
그림 12-6. 수직용 전기영동 장치
(A) 냉각 장치를 포함한 단백질 분리를 위한 전기영동 장치 (B) 겔을 만들기 위한 장치
대부분의 SDS-폴리아크릴아마이드 겔에서 아크릴아마이드 : 비스아크릴아마이드의 비율은 29 : 1이며 각각 다른 아크릴아마이드 농도에서 효과적으로 분리되는 단백질 분자량의 범위는 표 12-4와 같다.
표 12-4. SDS-PAGE에서 효과적으로 분리할 수 있는 단백질의 범위
아크릴아마이드 농도 (%)
단백질의 분리범위 (kD)
15
12 - 43
10
16 - 68
7.5
36 - 94
5.0
57 - 212
단백질 전기영동의 기본원리는 DNA나 RNA 전기영동의 원리와 같다. 다만, 단백질을 변성시키기 위해 우레아나 포름아마이드 대신 SDS를 이용한 폴리아크릴아마이드 겔 전기영동을 주로 이용한다는 것과 단백질을 눈으로 확인하기 위하여 EtBr 대신 쿠마시 블루(coomassie blue)나 실버(silver) 염색 방법을 쓰거나 항체를 이용한다는 것 등이 다른 점이다. 쿠마시 블루 염색에 의한 겔 상의 단백질 띠 검출은 염색제(dye)와 단백질 간의 비특이적 결합에 의한 것이며 0.3-1 mg의 단백질까지 인식할 수 있다. 실버 염색은 실버와 단백질 안의 화학잔기 간의 결합에 의한 것으로 2-5 ng 정도의 단백질까지 인식할 수 있다.
그림 12-7. 연속 완충용액과 불연속 완충용액 시스템을 이용한
원통(rod)형 겔과 판(slab)형 겔
(a) 연속 완충용액 시스템을 이용한 원통형 겔 (b) 연속 완충용액 시스템을 이용한 판형 겔 (c)와 (d) 불연속 완충용액 시스템을 이용한 원통형 겔과 판형 겔

키워드

전기영동,   sds-page,   단백질