PCR(polymer chain reaction)

목차

Ⅰ. PCR이란 무엇인가?
1. PCR의 각 과정
2. PCR의 구성요소

Ⅱ. PCR 실험방법

Ⅲ. PCR의 응용법

본문내용

은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 sensitivity와 ISH의 specificity를 모두 갖춘 방법이다.
실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나 slide glass 등의 사용에 적합한 IS-PCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 개발되어 있다.
IS-PCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질(예: PCR 용액에 들어 있는 salt 등)들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl, proteinase K 또는 Triton X-100 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 PCR이 끝난 후에 세포 안에서 증폭된 PCR 산물이 세포 밖으로 빠져나오는 원인이 되기도 한다. 그러므로 적당한 세제의 선택과 사용이 무엇보다 중요하며 PCR 산물이 세포 밖으로 유출되는 것을 막기 위해서는 single primer pair with complementary tail, biotinylated dNTPs, multiple overlapping primer pair 등을 이용한 방법이 소개되어 있다.
현재까지 IS-PCR 방법의 효율이 아주 높은 편은 아니지만 specificity를 높이기 위해서는 DNA probe를 이용한 in situ hybridization을 시행하거나 Southern blot hybridization을 실시하는 것이 큰 도움이 된다. 이 방법은 여러 가지 질병들의 조기 발견에 큰 도움이 될 것으로 예상되어 최근 많은 관심을 끌고 있는 방법이며 여러 회사에서 좀 더 유용하게 사용할 수 있는 IS-PCR용 기구들을 제작, 판매하고 있다.
8. RACE (rapid amplification of cDNA ends)
cDNA를 cloning하기 위해서는 cDNA library를 screening하는 것이 가장 일반적인 방법이지만 이 방법은 screening 작업을 반복적으로 여러 차례 실시해야 완전한 cDNA clone을 얻을 수 있다. 그러나 이 과정은 노동과 시간이 아주 많이 요구되는 실험 과정이며, 거의 완전한 clone을 얻은 후에도 5'과 3' 끝의 일부는 얻기 어려운 경우가 있다. 이러한 문제를 해결할 수 있는 것이 RACE이며 cDNA끝에 위치한 일부 염기서열을 알아내기 위해 사용된다.
3'-RACE 의 경우 mRNA의 3'-end에 존재하는 poly(A) tail을 이용할 수 있으므로 oligo(dT) primer를 downstream primer로 이용하고, 5'-RACE의 경우 gene specific primer로 합성한 first single strand cDNA 끝에 인위적인 terminal deoxynucleotidyl transferase를 사용하여 poly(A) 또는 poly(C) tail을 만들어준 후 이를 primer로 이용하여 PCR하고 염기서열을 결정한다.
9. Site-directed mutagenesis
특정 부위에 유전자 변이를 유발시키는 site-directed mutagenesis는 PCR에 의한 방법이 개발되기 전에는 아주 많은 노력을 요구하는 고된 작업중의 하나였으나 PCR에 의한 방법이 개발된 후에는 하루만에 간단히 원하는 위치에 변이된 유전자를 얻을 수 있게 되었다.
이 방법은 어떤 단백질의 기능부위를 연구하는 경우 의심되는 부위의 아미노산을 다른 아미노산으로 치환 또는 제거한 다음 기능의 변화를 관찰하여 기능부위를 규명하는 방법이며, promoter나 enhancer 연구에서 어떤 transacting factor가 결합하여 기능을 하는지을 알기 위하여 그 결합 부위의 염기서열을 변화시켜서 결합을 하지 못하게 한 후 promoter나 enhancer의 활성을 측정함으로써 그 transacting factor의 중요성을 타진할 수도 있다.
Site-directe mutagenesis를 쉽게 실시하기 위하여 여러 시약 회사에서 적당한 kit를 개발하여 판매하고 있으며 본 장에서는 대표적인 방법 세 가지를 간단히 소개하고자 한다.
첫째 Stratagene 회사에서 개발한 QuickChange Site-Directed Mutagenesis kit를 이용할 수 있다. 이것은 6시간 정도 소요되며 자세한 방법은 Stratagene 회사의 protocol을 참고하면 된다.
둘째 uracil을 함유한 single-stranded DNA를 이용하는 방법이다. 두 개의 중요한 DNA repair 효소인 dUTPase(dut)와 uracil N-glycosylase(ung) 유전자의 결함을 가진 E.coli strain에서는 thymine 대신에 소량의 uracil을 함유한 DNA가 합성되게 된다. 이와 같은 dut-, ung- strain에서 만든 single-stranded phagemid DNA를 template로 하고 mutation을 함유한 oligonucleotide를 primer로 시험관내에서 double-stranded circular DNA를 합성하여 wild type E.coli에 넣어주게 되면 두 가닥의 strand 중에 uracil을 함유한 phagemid DNA는 선택적으로 제거되고 시험관에서 합성된 DNA가 template로 이용되어 복제가 일어난다. 이 방법은 비교적 비용이 적게 든다는 장접이 있지만 uracil이 함유된 ssDNA를 제조해야 한다는 불편함이 있다.
셋째 PCR을 이용하여 mutation을 함유한 DNA fragment를 만들어 subclone을 제조하는 방법이다. 네 개의 primer을 합성하는 방법으로서 변이를 원하는 위치에 변이된 primer를 양방향으로 제조한 후 두 개의 시험관에서 각각 PCR을 실시한 다음 이 PCR 산물을 한 tube에 넣고 양쪽끝의 wild type primer을 이용하여 다시 PCR하여 얻은 산물을 subcloning하는 방법이다. 이 방법이 바로 PCR을 응용한 Site-directe mutagenesis 방법중 최근에 가장 많이 사용되고 있다.

키워드

PCR,   polymer chain reaction,   DNA 증폭