진클로닝, 마이크로인젝션(미세주입), 체외수정, 핵이식 실험보고서

소개글

진클로닝, 마이크로인젝션(미세주입), 체외수정, 핵이식 실험보고서에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 실험 제목 : Geancloning (mini prep)

2. 실험 목적 : 목적 DNA(ex: 외래 유전자를 삽입한 플라스미드)를 대량 생산을 목적으로 한다. mini-prep 에서는 E.coli에 넣은 gen을 빼내는 것을 목적으로 한다.

3. 실험 재료 : E.coli, centrifugation, 여러종류의 buffer(아래 실험방법 및 순서 참조), etube, filter... etc..

4. 실험 방법 및 순서 :
ⅰ 배양되고 있는 E.coli는 LB배양액과 섞인 상태이므로 centrifugation을 이용(13000rpm 10분)하여 밀도가 높은 E.coli가 pellet을 형성하도록 한다. (사진은 centirfugation을 모식적으로 나타낸 것.)

본문내용

현상이 일어나면서 두 개의 핵이 융합되고, 핵이 분열되고, 개체가 만들어지게 된다.
5. 실험 결과 :PN injection의 문제점은 주입한 DNA가 Random하게 들어가기 때문에(ex, 팔이나 다리에만 그 DNA가 존재하는 모자이시즘이 일어난다. integration 확률은 20%) P세대와 F1 세대를 걸친후, F2에서 그 형질이 발현된다.
1. 실험 제목 : in vitro fertilization
2. 실험 목적 : 체외수정
3. 실험 재료 : 돼지의 난소 (난자), 돼지의 정소 (정자), TL-HEPES, Tris (MTBM : Modified Tris Buffer Medium), SP-TALP...etc..
4. 실험 방법 및 순서 :
ⅰ생리 식염수를 이용하여 돼지의 정소를 세척, warming 하고, 정소상체 미부를 가위로 자른다.
ⅱ 정관에 정관 바늘을 삽입하여 TL-HEPES buffer medium을 주입하여 정액의 체취를 용이하게 한 후, 정액을 체취 한다. (정소 상체가 부풀어 오른다.)
ⅲ TL-HEPES와 체취한 정액을 잘 섞어 정자를 활성화 한 후 원심 분리기로 800RPM으로 5분을 돌린후, 위에 뜨는 medium을 버린다.
ⅳ 정자 중 200m 정도 채취하여 캡튜브를 이용하여 SP-TALP 2ml와 섞는다.(sperm tyrode's albumin lactate pyruvate)
ⅴ 약 15분간 인큐베이터에 넣어 두었다가 꺼내면 운동력이 활발한 정자가 떠올라서 작은 기둥이 형성 되는데, 이 중 200m의 정자를 뜬다. ; swing up(아래 그림 참조)
ⅵ 인큐베이터에서 난자를 metaphase 2단계까지 성숙시켜, first polar body가 나와 있는 상태로 만든다.
ⅶ oil로 tirs drop을 덮어서 오염을 방지한다. (modified tris buffer medium)
ⅷ 위에서 체취 중 10Nl 정자를 counting chamber 를 이용하여 관찰한다.
ⅸ 정자를 tris drop 에 (수정하기 위해서는 난자 1개당 정자 104개가 필요하다) 정자를 주입시켜 6시간 정도 방치한다.
ⅹ 여섯시간후 medium에서 culture를 한다.
1. 실험 제목 : nuclear transfer
2. 실험 목적 : NT를 이용하여 metaphage 2 의 난자에 체세포, 외래의 핵, 외부핵을 이용하여 같은 개체를 만드는 기술이다. 주로 돼지, 소의 난자를 사용한다.
3. 실험 방법 및 순서 :
미성숙 난자를 주사기로 채취하여 M2시기까지 배양한 후 M2 이후는 arrest 시킨다. 이 때 M2 단계는 난관팽대부에서 정자와의 만남을 위해 대기하고 있는 상태이다.
polar body 와 cytoplasm을 15~20%정도 제거하면 핵이 제거되는데, 여기에 외래의 핵을 삽입하고 전기충격을 통해서 핵융합 반응을 일으키도록 한다.
이렇게 하면 새로운 개체가 발생된다.
핵치환에 이용되는 세포는 난관세포, ear skin, fetus등이 사용되는데, 이번에 한 실험에서는 cumulus cell을 이용했다.
분화가 덜 된 세포를 사용할 수 록 NT의 성공확률은 더 커진다. (개체형성 확률 30% 미만)
이렇게 핵치환 된 수정란을 돼지 배를 갈라, 난관에 넣어주면 착상될 확률은 3% 미만이다.
결국 이 실험이 성공할 확률은 1000분의 9의 확률인 것이다.
이렇게 성공률이 낮은 원인은 돼지의 난자이다. 돼지의 난자의 cytoplas이 까맣기 때문에 핵구별이 어렵고 굉장히 sensitive 하기 때문에 조작이 어렵기 때문이다. (아래그림은 돼지의 난자)
** NT과정
ⅰ pipette(injection과 holding)을 준비하고 극체가 다섯시 방향에 위치하도록 조절한다.
ⅱ injection pipette을 찔러서 핵과 polar body를 제거한다.
ⅲ 외부의 핵을 삽입한다.
ⅳ 만들어진 clone embryo는 난구세포 유래의 어떤 개체가 된다. (ex : 소의 난자에 돼지 세포를 넣고 융합, activation 시키면, 5일때에 배반포를 생성한다.)
** NT의 특징
a. 최대한 in-vivo에 가까어야한다.
b. donor cell이 미분화될 수록 그 결과는 우수하다.
c. 조작인의 기술이 큰 영향을 좌우한다.
d. culture condition (PH, 습도, 온도, etc..)이 영향을 미치므로, 고려해주어야한다.
e. imprinting gene 분석이 중요하다. 작용기전이 중요하다.
( NT의 대표적인 예)

키워드

gene cloning,   micro injection,   in vitro fertilization,   nucler transfer,   진클로닝,   마이크로인젝션,   체외수정,   핵이식