PCR(Polymerase Chain Reaction)

소개글

PCR(Polymerase Chain Reaction)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. PCR이란?
2. PCR이 이용되는 실험
3. PCR의 의학적 응용
4. PCR을 하기위한 준비물
5. PCR 반응 각 성분에 대해 고려할 점
6. PCR 과정
7. PCR의 응용

본문내용

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cDNA를 cloning하기 위해서는 cDNA library를 screening하는 방법이 현재 가장 일반적이라 할 수있지만, 이 방법으로 처음 screening을 하여 찾아낸 clone은 대개 전체 cDNA의 일부이며 계속 반복하여 screening을 하여야만 완전한 cDNA를 얻어낼 수 있다. 그러나 이런 과정은 대단히 시간과 노력이 소모되는 작업이며 유전자 자체가 cDNA library에 적은 양으로 존재하는 경우는 더더욱 힘든 일이 될 것이다. 또한 initiation codon부터 termination codon까지 open reading frame(ORF)을 완전히 결정한 경우에도 cDNA의 5'과 3'-끝의 non-coding region 일부는 library screening에서 얻기가 어렵다. 이러한 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann 등은 다음과 같은 방법을 소개하고, 이를 RACE(rapid amplification of cDNA ends)라 이름하였다. 즉, cDNA의 일부 염기서열을 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR reaction을 통해 5' 혹은 3'-end 까지의 DNA를 증폭하는 것이다. 3'-RACE에서는 mRNA의 3'-end에 존재하는 poly(A) tail을 이용할 수 있으므로, down stream primer로 oligo-(dT) primer를 쓴다. 그러나, 5'-RACE의 경우는 gene specific primer로 합성한 1st single strand cDNA의 끝에 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여 poly(A) 혹은 poly(C) tail을 인위적으로 만들어 주어야만 한다.
⑷ ISPCR(In Situ Polymerase Chain Reaction)
PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 sensitivity와 ISH의 specificity를 고루 갖추고 있다. ISPCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, slide glass 등의 사용에 적합한 ISPCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.
ISPCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질(예: PCR 용액에 들어 있는 salt 등)들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl, proteinase K 또는 Triton X-100 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다. 이 과정에 이상이 생기면 세포가 손상되거나 파괴되는 수가 있으므로 PCR이 끝난 후에 세포 안에서 증폭된 PCR 산물이 세포 밖으로 빠져나오는 원인이 되기도 한다. 그러므로 적당한 세제의 적절한 선택과 사용이 무엇보다 중요하며 PCR 산물이 세포 밖으로 유출되는 것을 막기 위해서는 single primer pair with complementary tail, biotinylated dNTPs, multiple overlapping primer pair 등을 이용한 방법이 소개되어 있다.
현재까지 ISPCR 방법의 효율은 그다지 높지 못한 것으로 알려져 있으며 specificity를 증가시키기 위해서는 DNA probe를 이용한 in situ hybridization을 시행하거나 Southern blot hybridization을 시행하는 것이 좋은 방법이 된다. 효율이 별로 높지 못한 방법임에도 불구하고 ISPCR에 대한 관심이 최근 크게 증가하고 있는 것은 여러 가지 질병들의 조기 발견에 큰 도움을 받을 수 있을 것으로 기대되기 때문이며, 지금도 여러 회사에서 ISPCR에 유용한 기구들을 제작, 판매하고 있으나 더 좋은 기구의 개발이 이루어져 효율을 더욱 높일 수 있다면 ISPCR이 더욱 유용하게 사용될 수 있을 것으로 기대된다.
⑸ DDRT-PCR(Differential Display Reverse Transcriptase PCR)
일반적으로 고등동물에서는 약 100,000가지 정도의 서로 다른 유전자가 발현되고 있으며 각각의 세포 한 개에서는 이중 약 15%만이 발현되고 있다. 발생, 분화, homeostasis, 세포주기 조절, 노화, 발암과정 및 세포의 퇴화 등의 과정에서 표현되어 나타나는 유전자들은 전체 유전자들 중에서 일부가 선택되어 나타나는 것이라고 할 수가 있다. 특정 세포에서 발현되는 특정 유전자들을 찾아내기 위하여 주로 사용되는 방법은 subtractive hybridization 또는 differential hybridization 방법이었으나 최근 PCR을 이용하여 유전자를 찾아내는 방법(DDRT-PCR)이 개발되었다.
DDRT-PCR이란 서로 다른 세포로부터 RNA를 분리한 후 특정하게 발현되는 mRNA를 찾아내기 위하여 T 염기 10개와 비특정염기 2개가 연결된 oligonucleotide를 primer로 이용하여 cDNA를 합성한 후 이 primer와 비특정 염기서열을 지닌 oligonucleotide를 primer로 이용하여 PCR 하였을 때 나타나는 여러가지 PCR 산물을 비교함으로써 서로 다른 세포로부터 증폭된 PCR 산물에 차이가 있는지 없는지를 확인하는 방법이다. 서로 다르게 증폭된 PCR 산물을 선택하여 이와 같이 증폭된 DNA가 특정 세포에서 특징적으로 발현되는 유전자인지를 보는 것으로 subtractive hybridization보다 방법이 훨씬 간단한 것이 장점이지만, 실험의 sensitivity와 specificity가 낮은 것이 단점이다. 최근 이 방법에 대한 연구가 많이 진행되면서 새로운 더 좋은 방법들이 계속 발표되고 있으므로 최신 논문을 참고로 적절한 조건을 찾아내어 실험을 시행하면 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.

키워드

PCR,   polymerase chain reaction,   Taq DNA polymerase,   PCR의 과정,   polymerization