미생물 접종 및 배양 & Simple staining and microscopy

본문내용

2분의 1에 해당하는 길이를 분별할 수 있다. 현미경의 배율은 100배, 500배, 1,000배 또는 1,500배 등의 배율이 되고, 미생물 검사에 보통 1,000배를 일반적으로 많이 사용한다. 보통 광학현미경의 분해능의 한계는 약 0.2㎛로 세균, 리케차, 진균, 조류, 원생동물 등의 구별과 모양의 관찰이 가능하다.
나. 전자현미경(electron microscope)
전자현미경은 인류가 사용하고 있는 현미경 중에서 가장 정교하게 만들어진 현미경이다. 현재 가장 발달된 현미경이며 광원은 가시광선 대신에 전자선을 사용한 것으로 분해능이 대단히 좋고 균체의 미세구로 관찰에 사용되고 투과형과 주사형이 있다. 전자현미경은 음극선에 전장 또는 자장에 의하여 만곡하는 것에 착안해서 제작된 현미경으로 가시광선의 1/1000,000되는 초고속 전자파장을 이용하여 전자를 자장으로 통과시켜 condenser, 대물렌즈, 대안렌즈에 도달하도록 만들어진 것이다. 전자현미경의 배율은 연속가변으로 80배~800,000배이고, 매체는 진공, 렌즈는 전자렌즈로 자계적정전기적이며, 해상능력은 0.01㎛이고, 초점은 전기적으로 조절되고 명암은 산란흡수, 회절, 위상으로 나타난다.
2) 현미경 사용법의 목적
미생물 실험시간에 현미경 사용법은 매우 중요하다. 미생물은 육안으로 보이지 않고 현미경을 통해서 관찰해야 되기 때문에 현미경을 사용하는 방법을 잘 알아야 미생물 실험을 효과적으로 수행할 수 있다. 현미경을 이용하여 미생물 시료를 관찰하는 법과 현미경 취급법을 잘 알기 위함이다. 따라서 미생물의 실험 목적에 알맞은 현미경을 선택하여 검체를 명확하게 관찰하는 것이 필요하다. 현미경으로 검체를 관찰하는 것을 검경이라고 하며, 검경은 바람이 불지 않고 조용한 방에서 실시한다. 가능한 한 물리화학적 시험을 하는 방은 피하는 것이 바람직하다. 장시간에 걸쳐 검경을 할 때에는 신경을 써서 하게 되므로 피로가 쉽게 올 수 있으므로 주위의 소음을 가능한 한 없게 하고 의자나 시험대의 높이에도 주의를 해야 한다. 따라서 현미경 사용법의 목적은 육안으로 보이지 않는 작은 생물체를 현미경을 통해서 실험 목적에 알맞게 검체를 만들어 관찰하여 보다 더 명확히 보아서 그 결과를 얻는 데 있다.
3) 해상력(resolving power)
현미경은 확대율보다는 해상능력이 우수해야 미생물 관찰이 용이하다. 현미경의 해상능력은 ① 광선의 파장 ② 광선이 통과하는 매체의 굴절지수 ③ 대물렌즈의 구경으로 결정된다. 현미경의 해상능력은 두 개의 떨어져 있는 점을 서로 떨어져 있는 것으로 분별할 수 있는 최소 거리로서 분별한계라고도 한다. 이 해상능력은 광원으로 사용된 광선의 파장과 광선이 통과하는 매체의 굴절지수에 의하여 결정되는데 사람 눈의 해상능력은 0.1㎜이고, 광학현미경은 0.2㎛, 전자현미경의 해상능력은 0.0002㎛이다. 공기, 물 그리고 유침유(immersion oil)의 굴절지수는 1.0, 1.33 그리고 1.51이기 때문에 슬라이드 글라스를 통과한 광선이 대물렌즈와 슬라이드 글라스 사이에 공기층을 거치게 되면 슬라이드 글라스까지 직진해 온 광선들이 대물렌즈에 닿기 전에 굴절되어 조명도가 낮아지고 해상능이 감소하게 된다. 현미경의 해상능은 광원으로 사용한 광선파장의 1/2로 간주하지만 정확한 계산은 다음과 같다.
3. 시약 및 기자재
(1) 균주
Escherichia coli, Bacillus subtilis
(2) 시약
Methylen blue 또는 기타 염기성 생물학적 염료(Crystal violet, Carbol fuchsin), 증류수, 유침유
(3) 기자재
광학현미경, 염색대, 슬라이드, 백금이, 알코올램프, 흡지, 세척병, 유성펜
4. 실험방법
염색은 도말→건조→고정→염색→수세→건조→유침→검경 순이다.
(1) 슬라이드를 잘 세척 후 건조한다.
(2) 슬라이드의 멸균 겸 지방을 제거하기 위하여 화염에 2~3회 통과시킨다.
(3) 유성펜으로 슬라이드를 세 부분으로 나눈다.
(4) 슬라이드에 백금이로 깨끗한 증류수 한 방울을 떨어뜨린다.
(5) 멸균된 백금이로 균을 채취하여 슬라이드 위의 증류수와 잘 혼합하여 엷게 펴준다. 이때 도말이 너무 두꺼우면 후에 염색하여 볼 때 좋지 못하므로 가능한 엷게 편다.
(6) 사용한 백금이를 화염 멸균한다.
(7) 도말이 끝난 슬라이드를 공기중에서 건조시킨다. (단, 실습 중 급히 염색코자 할 때는 슬라이드를 화염에 왔다 갔다 수회하여 건조시킬 수 있다. 단, 너무 뜨겁게 하지 말 것)
(8) 공기중에서 완전히 건조된 슬라이드는 불꽃에 2~3회 통과시킨다. 이것을 열고정 이라 한다. 고정의 효과는 검체가 염색도중에 떨어지지 않도록 한다. 열고정시 화염 에 거치는 시간이 너무 길면 균체가 탈 수도 있으므로 조심하여야 한다.
(9) 검체를 염색대에 올려놓고 methylene blue를 적당량 떨어뜨린다. (Crystal violet이나 Carbol fuchsin과 같은 다른 염기성 염료도 사용할 수 있다.)
⑽ 약 2분간 염색한다.
⑾ 염색액을 세척병이나 수돗물로 제거한다. 수돗물로 수세시에 수압이 너무 강하여 검 체가 씻겨 나가지 않게 약한 수압으로 하고 가능한 한 검체 뒷면부터 물을 흘려보내 면 검체의 소실을 방지할 수 있다.
⑿ 슬라이드를 흡지에 가볍게 눌러 여분의 수분을 제거한 후 공기 건조시킨다.
⒀ 유침유를 슬라이드에 떨어뜨린 후 1,000배로 검경한다.
5. 실험참고사항
(1) methylene blue로 염색된 균은 청색으로 나타난다.
(2) Crystal violet으로 염색된 균은 보라색으로 나타난다.
(3) Carbol fuchsin으로 염색된 균은 적색으로 나타난다.
6. 참고문헌
(1) 한국미생물학회, 미생물학실험, 아카데미서적, 1987, pp.17~18
(2) 신현성 저, 최신미생물학각론실습, 도서출판 군자, 1989, pp.108~110
(3) 박승조 외 3인 공저, 환경인을 위한 분석화학실험, 동화기술, 2000, pp.232~ 234
(3) 김종오 외 4인 공저, 환경미생물학, 형설출판사, 1998, pp.511~515, 524, 548~551

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미생물,   접종,   배양,   staining,   microscopy