[분자유전학실험]2.Competent cell prep & Transformation of E. coli

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Material & Method
4. Result
5. Discussion
6. Reference

본문내용

이루어졌어야 했다. 하지만 결과는 colony가 발견되지 않았다. 무엇이 문제였을까? 이는 애초에 이전 실험에서 ligation과정 때 vector에 insert가 안 들어가는 등의 재조합 과정에서의 문제가 발생 되었을 수도 있고 아니면 우리가 형질전환 과정 중에 Competent cell에 ligation mixture가 제대로 이식되지 않았을 수도 있다. 또는 잘 들어갔지만 실험 중 heat shock을 가해줄때 흔드는 등의 어떠한 충격에 의해 다시 빠져나왔다고 예상 해볼 수도 있다.
③,④의 경우에는 이 역시 Competent cell에 애초에 만들어진 ligation mixture를 넣고 형질전환 시킨 것을 도말 후 배양한 것이다. 형질전환 시키기 위해 첨가시켜준 ligation mixture은 ②에 첨가해준 것과 같은 방법으로 만들어진 것이다. ③의 경우에는 8개의 colony가, ④의 경우에는 4개의 colony가 발견되었다. 일단 ①,②와는 다르게 Colony가 생긴 것을 관찰 할 수 있다. 이는 첨가해준 ligation mixture이 Competent cell에 잘 끼어들어가 형질전환이 일어났기 때문에 Ampicillin대한 내성을 가진 균주가 살아남아 생장하여 colony가 생겼다고 볼 수 있다. 하지만 colony의 개수가 20~50개 사이에 나와야 유효성이 있는 건데 우리 조는 그보다 밑으로 나왔으니 그게 형질전환 된 건지는 확신할 수 없다고 본다.
다른 조의 결과에서는 유효범위보다 훨씬 많은 colony가 생성된 것을 볼 수 있었는데 이렇게 너무 많은 colony가 생성되었을 경우, 재조합 되지 않은 세포가 돌연변이를 일으켜 살아남았을 수도 있으며, 항생제 배지를 만들 때 너무 높은 온도에서 항생제를 넣어주었기 때문에 항생제가 파괴되었을 우려도 있다. 또한 insert가 들어가지 않은 vector(제한효소 처리 후 자기자리에 그대로 다시 붙은 경우)의 경우에 항생제에 대한 내성부위는 가지고 있기 때문에 살아남아 colony가 나타날 수 있다. 따라서 이번 실험 같은 Transformation 실험 후에는 확인절차를 걸치는데 위에서 우리가 살펴보았던 선택배지 colony는 재조합 DNA가 재대로 들어갔는지를 확인하는 것이며, 이후에 PCR이나 다시 한 번 제한효소 처리를 해봄으로써 들어간 유전자가 우리가 재조합시킨 유전자가 맞는지 확인한다. 이 경우 우리가 원하는 유전가가 있으면 특이적 binding band가 나타날 것이며, 제한효소 처리 했을 때 원하는 유전자의 크기(재조합시킨 insert의 크기 473bp)로 잘릴 것이다. 그리고 마지막으로 재조합시킨 유전자가 맞는지 확인되면 Sequencing을 통해 염기서열을 비교해 봄으로써 완벽하게 Transformation의 성공여부를 확인할 수 있다. Sequencing의 경우 업체를 통해 쉽게 확인 가능하다.
6. Reference
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담당 교수님
유전공학의 이해 / 남상욱, 권혁빈 / 라이프사이언스 / 2008.07.20 / p89-90

키워드

competent,   분자유전학실험,   Competent cell