[기초유전학실험]3.PCR (Polymerase Chain Reaction)

목차

1. Abstract
2. Introduction
3. Material & Method
4. Result
5. Discussion
6. Reference

본문내용

것을 전제로 하나 primer 자신이 hair pin 구조를 형성해 버리면 목적 유전자에 결합할 수 없거나 다른 유전자와 결합해 버려 false positive의 원인이 되는 경우가 있다.
다행히 PCR 반응 중에는 열에 의한 변성 과정이 존재하여 그 과정에서 hair pin 구조는 해소되기 때문에 hair pin이 그만큼 중요시되지 않는 경우가 많다. 그러나 PCR 반응액 중 primer 농도는 target유전자의 농도에 비하면 압도적으로 많기 때문에 primer의 hair pin은 PCR감도를 저하시키는 원인이 된다.
Oligonucleotide 자체의 hair pin 구조를 형성할 가능성은 일반적으로 kcal/mol로 계산된다. 특히 한가닥 DNA나 cDNA가 주형인 경우 이들 DNA에 primer가 hybridize하는 것보다도 앞에 DNA 자체가 hair pin 구조를 형성해 버리면 primer가 hybridization할 수 없다. primer가 먼저 hybridizationg하면 그 중간부위에 있는 hair pin 구조는 DNA 합성 과정에서 해소되기 때문에 문제가 되지는 않는다. 그래서 적어도 primer가 hybridization하는 위치는 hair pin 구조를 만들기 어려운 부분이 이상적이다. 그러나 실제로는 primer가 대량으로 존재하고 primer 쪽이 표적 유전자에 비해 작은 분자이기 때문에 표적유전자가 hair pin을 형성하기에 앞서 primer hybridization할 가능성이 훨씬 높다. 따라서 표적 유전자의 hair pin은 그다지 문제가 되지 않는 경우가 많다.
(4) Primer의 상호작용
PCR 반응액 중의 primer의 농도는 표적 유전자의 농도와 비교하여 압도적으로 많기 때문에 primer간에 서로 hybridize하기 쉬운 구조를 갖고 있으면 이른바 primer dimer를 형성하여 target 유전자와의 hybridization이 대폭 억제된다. 이 primer dimer에는 sense간, antisense간 및 sense와 antisense간의 3종류가 있다. 한편 sense간과 antisense간에서는 hybridize하지 않는 것으로 착각할 수도 있다.
(5) 증폭산물의 위치
Cloning 등의 기초적인 실험의 경우 예를 들면 전단백질 정보영역 염기서열을 증폭하는 것처럼 PCR 산물의 위치는 실험의 목적에 따라 결정된다. 그러나 PCR을 이용해서 특이적인 유전자의 발현을 조사할 경우에는 PCR 산물의 위치에 관한 한정이 적어 primer의 설계에 융통성이 있다. 일반적으로 GC가 많은 부분을 PCR로 증폭하는 것은 어려워 상당히 특별한 know-how가 필요하다. 그래서 미리 표적유전자에 GC가 많은 부분의 존재여부를 확인하여 GC가 많은 부분이 증폭되지 않도록 primer를 설계하는 것이 바람직하다.
PCR 산물의 위치와 동시에 PCR 산물의 크기도 중요한 요인이다. 일반적으로 PCR 산물이 짧으면 짧을수록 증폭이 확실하고 감도도 증가한다. 길이가 1000 bp를 초과하면 더욱 특수한 know-how가 필요하다. 최단 길이는 primer dimer를 구별할 수 있는 길이면 가능하지만 이 경우 agarose gel 전기영동보다도 조작이 복잡한 acrylamide gel 전기영동이 필요하므로 그다지 일반적은 아니다.
(6) Primer의 길이
실험에 따라 10 mer 전후의 짧은 경우로부터 40 mer를 초과하는 긴 primer를 사용한 경우까지 다양하다. 기본적으로 sense와 antisense가 같은 Tm 값이 된다면 같은 길이로 할 필요는 없다. 길이가 길면 특이성이 증가한다고 오해하는 경우가 많지만 너무 길면 primer의 Tm이 annealing 온도보다 높아지기 때문에 mismatching을 갖는 잘못된 hybridization이 증가하여 특이성이 저하한다. 반대로 짧아지면 그만큼 비슷한 염기서열이 반응액 중에 존재할 확률이 높아 mismatching 가능성이 커진다. 단순히 human genome 유전자 총량으로부터 계산하면 17 mer(4의 17승 조합)까지는 human 유전자의 어딘가는 같은 서열이 있을 가능성이 존재한다. PCR의 경우 2종류의 primer와 반응해야만 되기 때문에 이론적으로는 17 mer로 충분하지만 일반적으로 20 mer 전후의 primer를 가장많이 사용한다.
primer 디자인을 한 후에 가상으로 확인하여 PCR이 잘 될지 안 될지 확인하는 사이트
http://compute.yeastgenome.org/cgi-bin/web-primer
http://www.premierbiosoft.com/primerdesign/index.html
PCR MgCl₂function
The polymerase requires a divalent cation (in this case Mg++ from the MgCl2) in order to function.
The Mg++ also helps stablize the two strands. A normal concentration of Mg++ in the reaction is 2.5uM. Higher concentrations yield greater promiscuity of the polymerase (ie false priming). Lower concentrations of Mg++ increase specificity of the target you're trying to amplify
6. Reference
Brock의 미생물학 제11판. MICHAEL T.MADIGAN외 저. 오계헌 외 역. 월드사이언스 2006
PCR 실험의 원리와 응용 . 최용락 외. 세종출판사.2003
알기 쉽고 재미있는 분자생물학 (3판) Molecular biology .이명석 외 역. 라이프사이언스 2007
http://translate.google.com/
실험날짜
학 번
이 름
담당교수님
http://cafe.naver.com/takarapcr.cafe?iframe_url=/ArticleRead.nhn%3Farticleid=7

키워드

pcr,   기초유전학실험,   Polymerase Chain Reaction