[레포트] 분자생물학 실험보고서 real time PCR 실험보고서

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목차

Ⅰ. 실험 제목
Ⅱ. 실험 목적
Ⅲ. 서론
Ⅳ. 실험 방법
Ⅴ. 실험 결과 및 분석
Ⅵ. 부록
Ⅶ. 참고 문헌

본문내용

의 상보성에는 특별히 주의한다.
*특이성 : BLAST 검색으로 primer의 특이성을 확인한다.
*Tm값 : Forward primer, reverse primer의 Tm값을 비슷하게 한다.
Tm값 계산은 전용 소프트웨어로 실시한다 (Tm ＝ 2（A＋T）＋4（G＋C）)
*증폭 사이즈 : 80~150 bp가 최적
*Primer의 size : 17~25 bp
qPCR할 때 문제해결법
문제점
원인
해결방안
증폭이 안되거나 Cq 값이 높게 나올 때
Enzyme이 활성이 완전히 안될 때
초기 Activation step을 확인.
a 정확하게 시간 엄수.
Primer design 문제
Melt curve나 agarose gel로 product 산물 확인.
a 최소한 2 primer pairs 준비하여 적당한 primer 이용
RT 과정이 너무 짧다.
최대 60분까지 5분 단위로 늘려본다
RT 온도가 너무 낮다
최대 65도까지 5도 단위로 늘려본다
RT reaction의 용량이 초과하여 억제현상 발생
Total QPCR 용량은 RT반응액이 10% 이상 초과하지 않음.
Annealing step이 너무 짧다.
최대 30초까지 3초 단위로 늘려본다
Template quality의 문제
Spectrophotometry로 Template 를 확인
(A260/280nm = 1.8 ~2.0)
Template 양이 불충분
합성이 가능한 충분한 양의 반응액 준비
Template 오염
Template를 10:1 또는 100:1로 희석하여 실험
불충분한 cycle
40 cycle까지 늘려본다.
PCR 효율이 너무 높다. (>105%)
SYBR Green이 Primer dimer 에서 반응
온도 조건을 잡는다
(예를 들어, annealing temperature를 2도씩 조절하여 최적화 한다)
Serial dilution 계산이 잘 못 됨.
새로운 샘플로 다시 수행하거나 정확한 농도 계산을 해본다.
반응액이 재현되지 않음
Pipetting 개선, 온도 조건 최적화, primer design을 다시함.
PCR 효율이 너무 낮다. (<90%)
Primer design 문제
Primer design sofeware를 이용하여 다시 디자인 한다.
a 최소한 2 primer pairs 준비하여 적당한 primer 이용
Annealing step이
너무 짧다
최대 30초까지 3초 단위로 늘려본다
Template의 오염
Template를 clean up 하거나 다른 방법으로 template를 추출한다.
Amplicon 이 너무
길다
적당한 Amplicon 사이즈는 100~150bp 이고, 500bp를 초과하지 않도록 한다.
형광 signal이 급격히 올라갔다가 감소되는 현상
형광값이 너무 빨리 올라가면 기본 baseline 앞쪽에 설정
Baseline 조절
증폭이 threshold에 미치지 못할 때
형광 baseline이 너무 높게 설정
Threshold는 조정가능하기 때문에 증폭결과에 따라 조절하거나 template를 dilution 한다(1:100 또는 1:1000)
증폭이 기하급수적으로 증폭되지 않을 때
Template의 오염
Template를 clean up 하거나 다른 방법으로 template를 추출한다.
Ⅶ. 참고 문헌
http://blog.naver.com/seoulinbio
http://blog.naver.com/nanohelix
http://blog.naver.com/kdrbiotech
T.A. Brown, 『유전자 클로닝 입문』 제 4판, 이병무 외 4명 역, 월드사이언스, 2004, pp.6~11, pp.33~35, pp.68~70.
Real time PCR 실험 protocol

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