Transformation

소개글

Transformation에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1.introduction
● Transformation 의 개념
● Competent cell 이란 ?
● Competent cell 을 이용한 Transformation 의 과정

2. materials

3. methods

본문내용

다. YAC은 진핵세포의 긴 유전자를 실험할 때 유용하며 200 - 1,500kb 까지 탑재시킬 수 있다. 따라서 YAC을 이용한 library는 human genome의 실험 등에 이용되게 된다.
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5. Plant Cloning Vector
식물 세포를 실험할 경우 가장 많이 이용하는 것이 Ti plasmid이다. Ti plasmid는 soil bacteria인 Agrobacterium tumefaciens에서 얻었는데, 식물에서의 일종의 tumor를 유발하는 유전자이다. Ti plasmid는 감염에 필요한 유전자와 감염 후 증식하기 위한 유전자로 구성된다. Ti plasmid의 특정 부분인 T-DNA(tumor-inducing DNA)는 감염후 식물 세포의 genome에 끼어들어가게 된다. 이 성질을 이용하여, T-DNA의 사이에 외부의 DNA를 삽입시키고 이 Ti plasmid를 지닌 A. tumefecien과 상처를 낸 식물 잎과 함께 배양하면 외부 DNA가 들어간 조작된 T-DNA가 식물 세포의 genome으로 끼워들어가서 형질 전환이 일어나게 된다.
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6. Mammalian Cell Vector
보통 진핵세포의 유전자 산물은 원핵세포의 경우보다 훨씬 복잡해서 단순히 E.coli 같은 개체에서 발현시키기가 힘들다. 진핵세포에 감염되는 바이러스인 SV40을 이용하는데, 이는 small, circular, couble stranded DNA tumor virus이다. 보통 genome size는 6kb 정도이다. 이 바이러스는 원숭이 세포 같은 경우 감염되지만 감염되는 host 자체가 제한적이다. 또한 탑재 가능한 DNA size가 제한적이다. 이 탑재 가능 공간을 확대시키기 위해서 SV40 유전자의 다른 부분을 제거하게 된다. retrovirus는 작은 single stranded RNA virus인데, 이는 다양한 숙주에 감염 가능하므로 응용 가능성이 훨씬 더 크다. 이의 viral genome은 2개의 single-stranded RNA이고 복제하기 위해서는 reverse transcriptase에 의하여 double-stranded DNA로 변환된다. 이를 vector로 이용할 수 있는 이유는 (1) provirus의 대부분의 유전자는 host cell에 감염 과정에서 helper virus가 사용되면 외부의 DNA로 치환될 수 있다. 또한 탑재할 수 있는 크기도 크다. (2) retrovirus는 세포에 감염하고 자신의 유전자를 높은 효율로 전달할 수 있다. (3) 다양한 host에 감염되며, 다양한 세포를 대상으로 실험 가능하다. (4) host genome에 끼워 들어가는 double stranded proviral DNA는 상당히 안정적이다. (5) virus는 host cell을 죽이지 않는다.
2. materials
plasmid vector(pUC19, ampicillin resistant), competent cell( E. coli DH5α) 100㎕가 담겨진 E-tube 2개, ice(4℃), LB broth, floating rack, water bath, 온도계, agar plate(LB, LB amp 각각2개씩 ), spreader, 알콜램프, incubator, rack, pipet, tip, polyglove, 70% 알콜
3. methods
▶ transformation
※주의: transformation동안의 모든 과정에서 cell과 접촉되는 모든
준비물은 완전히 멸균된 상태를 사용하셔야 하며, 실험이 진행되 는 동안 competent cell이 오염물질들에 의해 오염될 수 있으므 로 주의, 주의, 주의하세요!
※ 알콜램프 사용시 꼬옥∼꼬옥∼주의하세요!
① 미리 만들어서 E-tube에 담아 냉동시켜놓은 competent cell(100㎕) 2개을 ice에 30분동안 꽂아놓고 완전히 녹도록 한다.
② competent cell이 들어있는 2개의 E-tube중 1개는 plasmid vector( 5㎕ )을 넣고 가볍게 tapping하여 plasmid vector와 competent cell이 잘 섞이도록 하고, 다른 1개는 plasmid vector를 넣지 않는다.
③ ice에 5분 동안 둔다.(30정도 두면 더 좋음!)
☞ 얼음에 두는 시간은 competent cell의 종류와 실험목적에 따라 다르게 할 수 있다.
④ E-tube을 floating rack에 끼워 42℃ water bath에서 1min-2min동안 heat-shock을
준후 즉시 ice에 5min동안 꽂아두어 충분히 식힌다.
⇒잠깐 ! : E-tube을 움직이지 않게 하세요!
⑤ LB broth를 1ml씩 넣고 water bath(37℃)에서 20min-30min동안 incubation시킨다.
☞ 이 과정은 competent cell 내로 들어간 plasmid 내의 Amp 저항 유전자가 발현되도록 한다.
⑥ plate에 labeling한다. ex) LB plate : plasmid + c-cell / c-cell
LB amp plate : plasmid + c-cell / c-cell
⑦ 각각의 E-tube에서 100㎕씩 취하여 labeling된 plate에 맞게 떨어 뜨린 후, spreader로
액체가 흐르지 않을 정도까지 spreading(도말)한다.
<-- spreader
⇒잠깐 ! : spreader는 도말 직전에 반드시 70% 알콜에 담군후, 알콜 램프에 달구어
완전히 멸균된 상태로 사용하세요.
⑧ plate을 거꾸로 하여 incubator(37℃)넣어 8-12시간이상 키운다.
⑨colony 유무를 확인한다.
☞ 이때 보이는 colony는 한 cell에서 유래된것임.
♠이번 실험은 no.①-⑦까지 이며, colony확인은 다음 실험시간에........

키워드

형질전환,   유전자 재조합,   클로닝,   Competent cell,   Vector,   Bacteriophage