[생화학 실험] SDS-PAGE & Bradford assay

목차

1. 실험제목
2. 실험일자
3. 제출자
4. 목적
5. 원리
6. 시약 및 기자재
7. 결과
8. 고찰
9. 참고문헌

본문내용

방법은 단백질의 종류에 따라서 그 값이 변할 수 있고, Folin-Ciocalteu반응을 방해하는 물질들이 많기 때문에 단백질 용액에 그러한 물질들이 있는 경우 제거를 하거나 보정을 해주어야 한다. intergering reagent로는 detergents, Urea, Guanidine HCl, high sucrose, Ammonium sulfate, 0.1M이상의 Tris-HCl, EDTA, reducing agent 등이 있다.
2) Bicinchoninic acid (BCA) method
BCA protein assay는 Biuret, Lowry assay와 비슷한 화학적 원리에 바탕을 두고 있다. 분석하고자 하는 protein을 Cu2+와 bicinchoninix acid와 반응시킨다. Cu2+이온으로부터 만들어지는 Cu+는 BCA에 의해서 chelating되고 이는 BCA색을 초록색에서 보라색으로 변화시킨다. 이를 standard와 함께 562nm에서 측정하여 정량이 가능하다. 이는 Lowry, Bradford와 같이 sensitivity가 높고, 간단하다. 또한 Triton과 SDS 같은 detergent가 1%정도 존재하더라도 반응이 잘 일어난다.
3) Bradford method
Biuret method, Lowry method의 단점을 보완한 단백질 정량법으로서, Coomassie Brilliant Blue dye가 단백질과 결합하게 되면 최대 흡광 파장이 465nm에서 595nm로 qkRNlrp 되는 성질을 이용하여 595nm에서의 흡광량이 단백질의 농도를 나타내게 되는 방법이다. Coomassie Brilliant Blue G-250, Phosphoric acid, Methanol의 혼합물로 시판되는 Bradford solution이 assay법에서 요구되는 유일한 reagent이며, 단백질과 Bradford Solution의 반응은 2분안에 완결되고 발색정도는 1시간까지 안정하게 유지된다. Bradford assay의 sensitivity는 Lowry method를 능가하며 미량 정량법을 사용할 경우 1ug까지도 정량 가능하다. Interfering component가 Triton X-100, SDS 등으로 적다.
4) Biuret method
알칼리 조건하에서 구리이온이 단백질의 peptide nitrogen에 결합하여 540-560nm에서 흡광을 하는 보라색을 나타낸다. 이 반응은 UV 방법과는 달리 구리가 peptide nitrogen에 결합하므로 단백질의 amino acid의 조성과는 관계없이 일정하나 단백질의 양이 1~6mg/ml 정도가 있어야 하므로 sensitivity가 낮다는 단점이 있다.
Reference
-학부생화학실험(2) 후반부 교재
-학부생화학실험(1) 전반부 교재
-http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_purification
-Boyer.2000.Modern experimental biochemistry 3rd edition p41-44, p113-120

키워드

SDS-PAGE,   Bradford,   Bicinchoninic acid (BCA),   Lowry,   Biuret,   생화학 실험,   생물 실험,   실험레포트