E. coli 에서의 GFP 발현유도

소개글

E. coli 에서의 GFP 발현유도에 대한 보고서 자료입니다.

목차

 Title

 Purpose

 Introduction

 material

 Method

 result

 discussion

 reference

본문내용

phenol chloroform을 bacterial lysate와 같은 volume add, vortexing 후 centrifuge (Maximum speed 2min, 4°C)
10. Aqueous upper layer를 fresh tube로 transfer
11. 2volume의 Ethanol을 supernatant에 넣어 nucleic acid를 precipitation(vortexing으로 solution을 섞은 후 R.T, 2min)
12. -70°C에서 30min, store
13. 5min(4°C)동안 centrifuge하여 nucleic acid를 precipitation하여 collection
14. Gentle aspiration으로 supernatant제거, paper towel fluid 제거.
15. 1ml의 70% Ethanol을 pellet에 add. 2min Centrifuge하여 DNA recovery(invert)
16. Gentle aspiration으로 supernatant 제거
17. Tube side의 EtOH 제거, R.T에서 tube를 열어놓아 EtOH을 증발시킨다.(5~10min)
18. 20~50μl TE buffer로 nucleic acid dissolve DNA solution -20°C, store
19. electrophoresis
- PCR
1. Denaturation 95°C
2. Annealing 40°C
3. Extention(polymerization) 72°C
- DNA Elution
1. PCR sample(GEL)의 3volume의 Buffer UB buffer add.
2. spin column을 2ml collection tube에 장착
3. 1에서 얻어진 sample을 spin column으로 옮긴다.
4. 3을 10,000rpm으로 30초 centrifugation.
5. soup remove
6. spin column을 다시 collection tube에 장착.
7. spin column에 500μl Buffer UB를 넣고 원심분리(12,000rpm 30초)
8. soup remove
9. spin column에 750μl Buffer WB(80% EtOH)
10. soup remove 다시 2분간 원심분리
11. spin column을 새 1.5ml microtube로 옮긴다.
12. 30~50ml buffer EB add후 상온에 1분 store
13. 1분간 원심분리
- Ligation & Transformation
1. overnight culture한 cell을 5ml harvest
2. 250μl cell resuspension solution으로 pellet을 resuspension한다.
3. 250μl cell lysis solution을 각 sample에 넣고 4~6회 invert → 5′ RT에서 incubate
4. 350μl neutralization solution을 넣고 4~6회 invert
5. RT에서 10′, 원심분리
6. collection tube에 spin column을 insert
7. spin column에 cleared lysate을 넣는다.
8. 1′, 원심분리 → collection tube에서 soup을 버리고 column을 다시 insert
9. 750μl의 wash solution add → 1′ 원심분리 →discard soup
10. 250μl의 wash solution add → 1′ 원심분리 →discard soup
11. 2′, 원심분리
12. 새 ep tube에 spin column을 넣고 RT, 2′
13. 40μl의 nuclease free water를 spin column에 넣고 2′RT
14. 1′, 원심분리
15. discard column
16. store DNA at -20℃
Isolation of chromosomal DNA
1. cell culture 50ml
2. harvest at 4,000rpm, 10′
3. Resuspend in 5ml vs buffer
4. add lysozyme(4mg/ml)
5. RT에서 20′
6. add TSS buffer
7. RT에서 inverting
8. add 5M NaCl to final 1M
9. RT에서 5′
10. add the same volume of phenol : chloroform
11. 10′, 천천히 돌린다 →4,000rpm 5′원심분리 → take soup
12. add same volume of chloroform
13. 10′, 천천히 돌린다 →4,000rpm 5′원심분리 → take soup
14. add two volume of cold EtOH
15. DNA를 glass rod로 건져낸다.
16. foil로 rod를 닦아낸다.
17. Dry foil
18. TE에 dissolve
19. gel running
result
- pGFP plasmid isolation
- PCR product
- cracking
- GFP 발현 확인
6조 6번 / 6조 8번
6조 11번 / 6조 25번
chromosomal DNA
discussion
reference
- http://leesy106.com.ne.kr/gonghak/gonghak26.htm
- http://blog.naver.com/mj21204?Redirect=Log&logNo=40030275138
- http://100.naver.com/100.nhn?docid=775411
- http://100.naver.com/100.nhn?docid=709429
- http://blog.naver.com/baw6293157?Redirect=Log&logNo=25605376
- http://www.elpisbio.com/sub/support/protocols/SDS-PAGE-gel.htm
- http://www.fiu.edu/~animals/gel_solutions.html
- http://blog.naver.com/didwns1027?Redirect=Log&logNo=140012497300

키워드

대장균,   실험 레포트,   GFP