PCR, RT-PCR, Northern Blot, Western blot 에 관한 레포트~ 최고입니다

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있다.
전기영동으로 RNA를 분리하는 방법은 denaturing agent에 따라 Glyoxal / DMSO(Dimethyl sulfoxide) 방법(McMaster & Carmichael, 1977)과 formaldehyde 방법(Rave et al, 1979)으로 나눌 수 있다. 각각의 장단점은 있지만, 여기서는 formaldehyde에 의한 것을 설명하였다. Transfer하는데 이용되는 membrane중 Nitrocellulose membrane은 RNA와 nonconvalent하게 결합하지만 불가역적인(irreversible) 결합을 함으로써 hybridization 때 달라 붙어있는 핵산의 의미있는 소실이 없는 장점이 있는 반면, 두 차례이상의 hybridization과 washing에는 견디지 못하는 단점이 있다. 그러나, Nylon membrane은 이러한 NC membrane의 단점을 극복하여 수 차례에 걸친 hybridization에 견딜 수는 있으나, background hybridization이 더 많다는 단점이 있다. 따라서 prehybridization과 hybridization 과정 중에 blocking agents의 양을 증가시킴으로써 문제를 해결할 수 있다. 본 실험에서는 Nylon membrane을 사용한 경우를 나타내었다. 또한 Transfer하는 방법에 따라 모세관 현상을 이용한 Capillary Transfer, Vacuum을 이용한 Vacuum Transfer, 전기를 이용한 Electroblotting이 있으나, 여기서는 경제적인 Capillary Transfer에 대해 설명하였다. hybridization을 위한 probe의 방사선 동위원소는 반감기가 짧은 32P (14.3일)를 이용하였다.
이와 같은 방법으로 특정 RNA가 세포 안 또는 조직 안에서 transcription(전사)되는 지의 여부와 전사되는 상대적인 양과 안정도를 정량화할 수 있다.
Northern Blot에서 좋은 결과를 얻기 위해서는 가장 조심해야 할 것이 RNase의 오염을 방지하는 것이다. RNase는 실험하는 사람의 손에도 많기 때문에 절대 맨손으로 다루어서는 안되고, 기구나 시약 모두 RNase free하게 만든 후 사용해야 한다.
4.Western blot
특별한 항체를 이용하여 단백질 혼합물 중에서 원하는 단백질만 찾아내는 방법이다. 매우 특이성이 높은 항체를 사용한다. 단백질 혼합물을 분자량, 크기와 전하 혹은 등전점에 의해 분리시킨 후 특정 단백질을 검출하는데 매우 효율적인 방법이다.
1) SDS-PAGE (SDS-Polyacrylamide Gel Electrophoresis)
- 단백질들을 재생시켜 단백질의 분자량에 의하여 이동 속도를 달리하여 분리시켜서 단백질 검 출에 사용하는 전기영동 방법
- 전기영동이란 단백질이나 핵산 등의 고분자물질은 하전을 띄므로 이를 기초로 하여 이들 분 자를 전기장을 띤 gel에서 이동 분리시켜 이들의 순도나 성질의 분석 및 분리 등에 사용하는 방법
2)Western blot 원리
세포 또는 조직의 추출물을 전기 영동하여 그 속에 들어 있는 단백들을 크기 별로 구분
흡착지에 옮겨 놓고 조사하고자 하는 단백의 항체와 결합
단백의 존재 유무와 크기 등을 밝히는 검사, 면역 블롯팅이라고도 불림
3)Western blot 방법
(1)여러가지 단백들을 함유하고 있는 혼합액을 SDS가 포함되어 있는 폴리아크릴아마이드겔에 서 전기 영동a 단백들을 크기에 따라 분리하여 나열 시킴
(2)폴리아크릴아마이드 겔에 흡착지를 겹쳐 놓고 전기를 걸어 겔 속에 있던 단백들을 흡착지 로 이동시킴.
(3)흡착지를 보합결합 주머니에 넣고 어떤 단백의 항체를 포함한 보합결합 용액과 함께 배양 한 후 다시 그 항체에 대한 항체와 반응시킴
(4)발색제를 함유한 반응액으로 처리
페록시다아제에 의하여 과산화수소가 분해될 때 발생하는 발생기 산소가 발색반응을 일으키고 흡착지 위에 존재하는 단백은 띠 모양으로 나타남.
4) Western blot 응용
- 어떤 단백이 일정한 세포 속에 발현되고 있는가를 확인하거나 그 발현되는 단백의 크기 변 화를 관찰하는데 이용.
- 최근에는 화학 발광을 일으키기 위한 효소가 결합되거나 방사성 동위원소로 표지된 항체를 이용
- 세포 용해물의 단백질 혼합액 대신 면역 침강 단백질을 이용함으로써 western blot의 감도와 특이성 증가. 이와 같은 기법은 특히 단백질-단백질 상호 작용을 확인하는데 유효함

키워드

PCR,   RT-PCR,   Northern Blot,   Western blot,   RT PCR