세포생물학- PCR-Southern hybridization

목차

1.Introduction

*Reference

2. Materials

3. Method

4. Result

5. Discussion

*Reference

본문내용

4∼5 mm와 1% 이하의 agarose 농도의 gel로부터 30분 이내에 이동하게 된다. 성공적으로 수행되었을 경우 모세관 현상을 이용한 이동 방법에서 얻은 hybridization signal 보다 2배 내지 3배 강한 결과를 얻을 수도 있다. transfer가 끝나면 정확한 위치를 알기위해 membrane에 gel의 홈을 표시한다. 그 다음 membrane에 UV를 쬐는데, 이유는 membrane과 DNA를 보다 강하게 결합시키기 위해서이다. DNA상에 thymidine residue와 membrane의 +charge를 띠는 amino group이 cross linking 하게 된다. 그 뒤 42도씨에서 1~2시간 정도 혼성화의 전처리 과정을 거친다. 이 과정이 있어야 probe가 잘 붙을 수 있게 되는 것이다. 이 때, 처음으로 수행하는 것이 SSC로 membrane을 washing한다. 그렇게 하면 수소결합으로 이루어진 강한 결합들만 남고 나머지, 자리를 잘 못 붙어 있던 약한 전하의 결합들은 떨어지게 된다. 그러고 난 뒤 혼성화를 하는데, 이 또한 42도씨에서 수행한다. 왜냐하면 혼성화는 효소 반응이므로 혼성화 과정은 효소 반응이 잘되는 온도에서 하게 된다. 수행한 뒤에 여분의 probe를 없애기 위한 과정을 거친 후 blocking soln으로 membrane coating하는 과정을 거친다. 이것은 ,probe는 붙어 있는데 dig 빼고 남은 부위를 blocking시켜 dig만 발색하게 하기 위해서 이다. 그리고 Alkaline phosphatase를 dig에 붙이는 과정을 순차적으로 진행하는데 각 과정은 30분이상 초과하는 것은 좋지않다. 시간이 길어지면 원래 붙어야할 dig이외에 붙을 수도 있기 때문이다. dig와 alkaline phosphate를 결합시키는 것은 dig를 항원으로 인식하여 진행되는 항원-항체반응이다. 그런 뒤에 detection soln으로 처리하고 color reaction을 시킨다. 우리는 color reaction을 위해 western blue (NBT/BICP)를 이용했는데, 이것은 dig-alkaline phosphate가 결합한 곳에서 파란색보다 보라색에 가까운 색을 띤다.
*Reference
유전자공학의 원리/심웅섭/고려대학교출판부/1999
유전공학/Watson/탐구당/1995
유전자 클로닝 입문/T.A.Brown, 이병무 외 4인/월드 사이언스/2003

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