PCR 기술의 원리와 예, 응용사례

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PCR 기술의 원리와 예, 응용사례

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microfuge tube를 반전시키며 반응시켰다. 유화된 액체를 15분간 2,750g에서 원심을 돌린다음 상층 수용액을 깨끗한 microfuge tube로 옮겼다. 필요하다면 상층수용액에 phenol/chloroform 용액을 다시 첨가하여 다시 단백질 성분을 제거한다. 깨끗한 microfuge tube에 옮긴 상층의 수용액층에 냉각시킨 3M sodium acetate 100㎕와 냉각시킨 isopropanol 1㎖을 첨가하여 DNA를 첨가시켰다. 유리막대를 이용하여 DNA를 건져낸 뒤 냉각된 70% ethanol로 세척한 다음 이를 잠시 건조시킨후 buffer(10mM Tris, 1mM EDTA, PH7.5)에 녹였다. DNA를 녹이는데 드는 buffer의 양은 침전량에 따라 다르게 일반적으로 250∼500㎕정도로 녹였다.
▶PCR 술식
PCR에 사용된 primer는 B204를 사용하여 작성된 특이적인 1,700kb의 진단용 소식자에서 얻어진 DNA 배열의 일부로부터 작성되었다. 이 배열의 정보는 약 320 base pair였으며 BGC sequence로 명명되었으며 이는 PCR에 유용하게 사용되었다. 사용된 primer의 배열은 (BC5)5'-GAA TTA ACA GCA GAA GA-3'과 (BC4) 5'-CAT CAT TTG ATG ATT CTT GA-3'로 이들은 약 180bp의 산물을 생산하였다. PCR반응 용액의 구성은 10% reaction buffer, 2mM magnesium chloride, 각각 dNTP(Boehringer Mannheim) 2.5nmole, 각각의 primer 3 pmoles, Taq polymerase enzyme 0.5 unit로 구성되었다. 반응 용액양의 나머지는 고압증기 멸균된 3차 증류수를 사용하였다. 술식은 첫회의 변성과정을 94℃에서 4분 30초간한 것을 제외하고는 나머지 반응은 94℃에서 30초간, 55℃에서 60초간, 72℃에서 45초간으로 35회 반응을 시켰다. 모든 PCR은 GeneAmp PCR system 2400(Perkin Elmer)에서 반응시켰다.
▶PCR 생성물의 확인
PCR의 생성물을 다음과 같이 확인하였다. Tris borate buffer(0.045 M Tris, 0.045 M Borate, 0.001 M EDTA, PH8.0)를 running buffer로 하고 0.7% agarose gel에서 10㎕의 PCR 산물을 가지고 전기영동 한다음, ethidium bromide용액(0.5㎍/㎖)을 이용하여 염색한 다음 자외선으로 관찰하여 특이 band를 확인하였다.
▶PCR의 탐색한계 측정
PCR의 탐색 한계를 조사하기 위하여 S. hyodysenteriae strains A1 균주의 pellet에서 DNA를 추출한 다음 이를 분광광도계를 가지고 정량측정하였다. 정량된 측정값을 이용하여 멸균된 3차 증류수의 2.5㎕용액에 DNA가 100ng에서 0.1pg까지 되게 10배 계단희석하였다. 이를 PCR기법을 이요하여 증폭시킨후 탐색한계를 조사하였다. 3.결 과 이 연구에서 이용된 PCR기법을 이용하여 S. hyodysenteriae의 모든 균주의 추출물로부터 DNA가 증폭되지 못했다. DNA band는 한가지의 특이적인 band만이 보이지 않고 여러 가지 band가 형성되었다. 그 중 주요한 band는 세가지이며 이들 세 개의 주요 band는 예상되었던 180bp를 포함하고 있었다. PCR의 민감도를 확인하기 위해 S. hyodysenteriae에서 추출된 DNA를 멸균 증류수에 10배 계단희석한 뒤 이를 반응시켜 보았다. 그 결과 1pg의 DNA까지 검출되었음을 확인할 수 있었다.

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