[생명공학] 기본적인 DNA manipulation 실험 방법들

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본문내용

10X buffer (H) 1.5㎕
restriction enzyme : Xho I 0.5㎕
EcoR I 0.5㎕
D.W. 10.5㎕
※ 두 개 이상의 restriction enzyme사용 시 활성을 비교하여 buffer선택.
※ 단순히 check를 목적으로 할 경우 restriction enzyme은 대게 0.5㎕ 사용.
※ enzyme은 항상 ice에 보관.
※ 양이 많은 것부터 순서대로 넣되 enzyme은 항상 맨 마지막에 넣는다.
Ligation
☆ vector : cloned gene(insert) = 1 : 3 이 가장 이상적.
여기서 1:3 은 volume ratio or mass ratio 가 아님.
nucleotide의 길이와 mass를 따져서 vector와 cloned gene(insert)의 개수 비
예) (vector의 크기가 5kb일 때) 100ng안에 30개의 vector가 들어 있다면
(1.3kb크기의) insert는 100ng안에 90개정도가 있어야함.
이는 PCR 후 사진 위 band의 밝기를 통해 경험적으로 판단함.
total 20㎕ 20㎕
vector 0.5㎕ 0.5㎕
insert 2㎕ - ⇒ control로서 self ligation 확인 목적.
buffer 2㎕ 2㎕
ligase 1㎕ 1㎕
D.W 14.5㎕ 16.5㎕
cell 접종 (clean bench에서 실시)
※ 액체 배지 : antibiotics (for selection) = 1000 :1
배지마개 열고 닫을 때 항상 alcohol lamp로 소독.
ⓐ 먼저 적당량 (배지의 1/1000) antibiotics를 딴다.
ⓑ 배지가 들어 있는 test tube 입구부분을 alcohol lamp로 가열한 후
뚜껑을 열고 antibiotics를 넣는다.
ⓒ alcohol lamp로 test tube의 입구와 마개를 소독한 후 막는다.
ⓓ stack으로 보관한 plate에서 pipette tip으로 colony를 딴 후 ⓑ 한 다음 tip 채로
넣고 ⓒ.
ⓔ incubator에서 배양한다.
Transformation (using heat shock method)
ⓐ -80℃에서 보관한 competent cell을 ice에서 2~3min 넣어 녹임.
ⓑ clean bench에서 competent cell 100㎕을 따서 plasmid(vector) 10㎕에 넣고
tapping하고 ice에서 40min 대기.
⇒ competent cell : plasmid = 10 : 1. 이보다 클 경우 효율 낮아짐.
plasmid가 competent cell membrane에 붙어 있음.
ⓒ 42℃에서 1min 30sec 동안 heat shock.
ⓓ 1min간 ice에서 안정화시킴.
ⓔ clean bench에서 LB배지 800㎕ 넣고 37℃ shake incubator에서 45min 동안 배양
⇒ 나중에 antibiotics를 이용하여 transformation 된 cell을 찾음.
이를 위해 먼저 cell이 건강하게 자라도록 antibiotics가 없는 LB배지에서 기름.
ⓕ centrifugation 3000rpm 5min 한 후 pellet 부분 supernatant 포함하여 100㎕ 정도만 남기고 나머지 버림.
⇒ antibiotics가 깔려 있는 plate 배지에 spreading 했을 때 잘 흡수되도록 필요 없는 부분 양을 줄인 것임.
ⓖ 남아 있는 100㎕로 pipetting 하여 pellet을 완전히 녹임.
ⓗ antibiotics (for the selection) 깔린 Petri dish 배지에 붓고 골고루 spreading.
37℃ incubator에서 배양.

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