영양생화학실험A+)효소활성도 측정 ( Glutathion peroxidase ; GPx)

소개글

영양생화학실험A+)효소활성도 측정 ( Glutathion peroxidase ; GPx)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1.주제
2.재료 및 기구
3.실험목적 및 원리
4.실험방법
5.실험결과
6.고찰
7.참고문헌

본문내용

1. 주제 Glutathione Peroxidase 활성 측정
2.
재료
및

기구 기구 96 well plate, pipette, centrifuge, spectrophotometer
시약 PBS, calibrator, d.w,
Working reagent ( assay buffer, glutathione, NADPH, GR enzyme)
H2O2 , Gpx (glutathione peroxidase), sample (1~4)
3.
실험 목적

및
원리 목적 Gpx의 효소활성도를 측정함으로써 특정 시료의 항산화능을 알 수 있다.
원리 ↓ Gpx (Glutathione peroxidase) ↓G.R (Glutathion reductase)
2GSH + H2O2 → GS–SG (glutathione disulfide)+ 2H2O → 2 GSH + NADP+
↑NADPH

Gpx(Glutathione peroxidase)가 과산화산소(H2O2)를 환원시킴에 따라 산화된 glutathione 즉, glutathione disulfide 가 생성되는데 이 산화형의 glutathione (glutathione disulfide)이 GR (glutathione reductase)에 의하여 다시 환원형의 Glutathione (GSH)으로 환원되는 동안 NADPH가 NADP+로 산화되므로 이를 340 nm에서의 흡광도 감소(NADPH는 340 nm에서 빛을 흡수하나 NADP+는 흡수하지 않음)를 이용하여 측정한다.

4. 실험 방법
1. Sample preparation
① homogenized cell in 200ul cold PBS, centrifuge 10min at 14000rpm.
② 상층액만 e.p tube에 넣어 -20C 보관

2. Standard
① Calibrator 6ul에 증류수 94ul를 섞어 6mM의 NADPH 100ul를 만든다.
② 제조한 6mM의 NADPH를 3.6mM, 1.8mM, 0mM로 각각 희석한다.

standard 6mM NADPH Vol (ul) [Equiv.NADPH] (mM)
calibrator H2O
1 50ul 0ul 50 6
2 30ul 20ul 50 3.6
3 15ul 35ul 50 1.8
4 0ul 50ul 50 0
3. Working reagent (X22) 제조
① Assay buffer 1870ul + glutathione 44ul + 35mM NADPH 44ul + GR enzyme 176ul를 혼합한다.

4. 0.35mM H2O2 (X22) 제조
① 3.5mM H2O2 228ul + DW 2376ul 을 혼합한다.

5. 96well plate에 다음과 같이 각각 분주하고 340nm에서 흡광도를 측정한다.
① 2분 간격으로 3-4번 반복 측정한다.
*H2O2는 흡광도 측정 직전에 넣고 측정한다.

[표1. 96 well plate 분주 배치도]
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
A
B Standard1 Standard1 Standard1 Gpx
Only Gpx Positive
Control Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 Control
C Standard2 Standard2 Standard2 Gpx
Only Gpx Positive
Control Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 Control
D Standard3 Standard3 Standard3 Gpx
Only Gpx Positive
Control Sample1 Sample2 Sample3 Sample4 Control
E Standard4 Standard4 Standard4
F
G
H
*각 시료의 조성
Standard : standard 10ul + assay buffer 190ul
Gpx Only : Gpx 10ul
Gpx positive control : Gpx positive control 10ul + working buffer 90ul + 0.35mM H2O2 100ul
Sample : sample 10ul + working buffer 90ul + 0.35mM H2O2 100ul
Control : assay buffer 10ul + working buffer 90ul + 0.35mM H2O2 100ul

6. Standard curve를 그리고 공식에 따라 sample의 Gpx 의 농도를 구한다.

키워드

효소 활성도,   GPx,   효소,   양생화학실험