키틴을 이용한 크로마토 그래피 실험 레포트

소개글

키틴을 이용한 크로마토 그래피 실험 레포트에 대한 보고서 자료입니다.

목차

Ⅰ. 서 론

Ⅱ. 각 주별 실험 방법 및 이론과 결과 분석
1주차 실험 - 조효소의 분리
2주차 실험 - Anion exchanger chromatography (음이온 교환수지법)
3주차 실험 - Cation exchanger chromatography (양이온 교환수지법)
4주차 실험 → HIC (hydrophobic interaction chromatography)
5주차 실험 - affinity chromatography
6주차 실험 - protein 정량 (by Lorry and Folin method at mg level)
7주차 실험

Ⅲ. 결 론

본문내용

시료를 용매에 녹이기 어려울 경우에는 시료제조상의 대책이 필요하다.
시료에 따라서는 측정을 방해하는 화학 발광(Chemical luminecence)의 발생을 초래하는 수가 있다.
<용 도>
주어진 시간(보통 분당으로 함 )내에 light의 flash가 얼마나 많이 detecting 되는가를 계수하는 장비로써 기기의 효율과 계산하여 DPM(disintegration per minute, 분당 붕괴수)으로 환원하여 동위원소량을 결정하는 검출용이며, 또한 각각의 동위원소에 따라 spectrum이 고유한 관계로 이를 분석하여 파악할 수 있다. 따라서 시료량이 매우 작은 hemoglobin, tissue, hormone 세포내 미량물질(DNA,RNA)을 분석하는 연구에 사용된다.
- 결과분석
CPM(count per mintue)A
DPM(disintegration per minute)1
SIS
anion unbound
1249
4367.63
10.455
anion bound
1001.67
3428.7
10.49
cation unbound
827
2894.84
10.443
cation bound
863
2929.67
10.547
HIC unbound
783.67
2615.38
10.757
HIC bound
762.33
2589.53
10.532
일반적으로 CPM은 count per minute로 방사능 계수에 이용되며, 0.01mg/㎥를 의미하나 기계의 종류에 따라 그 값이 다르다. 여기에서는 일반적으로 적용되는 단위를 이용하여 생각하기로 한다. CPM의 경우 bound된 chitinase의 경우, anion>cation>HIC의 순으로 그 값이 높았다. 이는 3중수소와 chitin의 결합을 끊는 힘이 앞의 순서에 따라 강하다는 것을 의미한다.
DPM은 disintegration per minute의 약자로 분당 방사성 물질의 붕괴의 정도를 나타낸다. 여기에서도 cation bound의 값은 cation unbound의 값보다 높게 나왔는데, 역시 3주차 실험에서 나타난 실수라고 생각된다. CPM과 마찬가지로 chitin과의 결합에서 나오는 3중수소의 양도 anion>cation>HIC의 순으로 나타난다.
chitin은 원래 불용성이지만 pH 4.5 buffer에 두면 chitinase에 의해 oligomer 형태가 된
다. 따라서 용융액을 Centrifuge 한 후에 cell down을 시키고 상등액을 취해 반응하는
[H] 을 측정하게 되면 chitinase의 Activity를 알 수 있게 되는 것이다.
Ⅲ. 결 론
이번 실험의 주된 목적은 실험 manual에 나와있는 대로 닭근위(모래주머니)에서 protein 과의 복합체로서 함유되어 있는 다당류인 chitin의 (1,4) 결합을 가수 분해하여 절단, pro
tein으로부터 chitin을 분해하는 효소인 chitinase를 효율적으로 분리해내는 기작을 찾아보는
실험이었다. 더불어 chitin이 함유되어 있는 protein의 특성을 파악하기 위한 다양한 과정을
실험해보았다.
이상의 실험결과를 토대로 종합해보면, 2주차의 실험에서는 일단 unbound의 영역이 bound보다 크게 나타난 것을 볼 수 있다. 즉, 상대적으로 음이온이 charge되거나 중성인 단백질은 양이온으로 charge된 단백질보다 많다는 것을 의미한다. 3주차의 실험은 2주차와 반대로 컬럼이 음이온으로 charge되어 양이온으로 charge를 띤 단백질들을 달라 붙게 한다. 2주차 실험에서 어느 정도 예측되었듯이 상대적으로 음이온으로 charge된 단백질이 많아서 중성과 양이온이 단백질이 나온 unbound와 bound의 영역의 값이 크게 차이가 나지 않음을 확인할 수 있다. 4주차의 실험은 단백질의 hydrophobic interaction작용을 이용한 것으로 처음에 나오는 것은 상대적으로 친수성을 띤 단백질이고 나중에 나오는 것은 소수성인 단백질이다. 그래프의 결과를 토대로 kitinase가 상대적으로 소수성을 띄고 있음을 알수 있다. 5주차는 lowry-folin식을 이용한 정량 실험으로 농도를 다르게 하여 버퍼를 주입하여 그래프를 얻은 뒤 linearization을 통해 농도와 흡광도 값을 X, Y측으로 하여 추세선을 그리고 이것을 토대로 crude 값의 농도를 구해볼 수 있다. 하지만 실험결과 많은 오차가 생성되었는데, 이것은 실험시 pipeting의 미숙이라든가 불순물이 들어갔을지 모르며 흡광도 실험시 여러 불순물이 잔재하여 흡광도 실험에 영향을 미쳤을 수 있다. 6주차 실험인 electrophoresis는 단백질의 상대적인 크기와 charge를 이용하여 단백질을 분석하는 실험으로 생각보다 결과가 정확하게 나오지 않았다. 이는 실험시 dialysis와 PD-10을 이용한 농축이 제대로 되지 않아서 그럴수 있으며 또한 well에 pipetting시 실험자에 의한 실수 가능성도 있다. 또한 stacking region에서 separate region으로 분자량에 의한 이동시 병목현상이 발생하는데 이 때 잘못 들어간 불순물에 의해 상호 unlike chare를 띈 것들이 작용하여 분리되는데 방해가 되었을 수 도 있다. 또한, 여러주를 통해 실험하는 동안 단백질의 변성을 생각해 볼 수 도 있다.
Ⅳ. 참 고 문 헌
키틴.키토산 및 키틴.키토산-올리고당 미성교역(주) 정태진 생화학 김명순·김종화 외 11인, 형설출판사 (1999)
생화학 (상) 채범석 역, 서울외국서적 (1996)
moleculatr biology / malacinsky / jones and bartlett / P25~29
microbiology / klein / mcgrawhill / p318~321
브리태니커 백과사전(CD version)
http://www.naver.com 문서검색, 두산 encyber 백과사전
http://nmr.kaist.ac.kr/chae/lecture_note/index.htm
http://bric.postech.ac.kr/topic/63.html
http://labbank.co.kr/labbank/analyzer/use/chro/chro.htm

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