액체크로마토그래피-HPLC에의한카페인분석-1

목차

ABSTRACT

INTRODUCTION

DATA AND RESULT

DISCUSSION

REFERENCE

본문내용

273.8㎚의 빛을 사용하면 Beer의 법칙을 적용하더라도 큰 오차없이 분석(4번 항목)을 할 수 있게 된다.
이제 마지막으로 caffeine의 정량분석을 해보자. 앞의 분석결과에서 보는 바와 같이 Beer의 법칙을 적용하기 용이한 파장인 270㎚의 복사선으로 caffeine을 검출하였다. 이제는 앞의 실험들과는 달리 흡광도의 peak값이 아니라, 흡광도의 peak값을 갖는 봉우리의 면적에 주목해야한다. 앞의 실험분석에서는 정성적인 차원에서 분리시간과 흡광도가 좋은 빛의 파장을 찾는 것이 주목적이었지만, 마지막 실험에서는 정량적으로 커피의 양을 분석하는 것이 목적이기 때문이다. 연속적으로 변화하는 시간과 연속적으로 흐르는 용매속에서 caffeine은 연속적인 흐름을 가지게 되고 검출기는 고정된 상태에서 매 순간순간 마다의 흡광도는 그 순간의 caffeine의 양에 좌우되기 때문에 이런 흡광도의 값을 시간에 따라 모두 합한 즉 적분을 한 값이 전체 caffeine의 흡광도가 되는 것이다. 그리고 Beer의 법칙에 의해 농도는 흡광도에 비례(5번 항목)하게 되므로, 면적의 비가 곧 물질의 농도의 비와 같게 되는 것이다.
뿐만 아니라 ‘크로마토그램은 유속이나 온도 등 여러 가지 변수에 의해서 봉우리 모양이 영향을 받지만 면적은 그에 무관하다. 그러므로 면적은 높이보다 더 만족스러운 분석 파라미터가 된다.’9) 그리고 ‘일반적으로 같은 농도의 두 분석물질도 크로마토그래피에서 검출기의 감응이 같지 않기 때문에 각 분석물질의 기지 농도에 대한 검출기 감응을 측정해야 한다. 특정한 물질의 기지 농도가 포함된 표준용액을 만들어서 컬럼에 주입하여, 얻어지는 봉우리의 면적을 측정하여 분석물질의 농도에 대한 검출기의 감응을 나타내는 표준곡선’10)을 그리면 이 표준곡선 위에서 우리가 찾는 미지용액의 농도를 예측할 수 있다.
실험 3의 결과에서 두 표준용액의 크로마토그램을 통해 얻은 standard curve의 식은 y=353.7795+10.270868x(Data&result 참조) 이며, 커피에서 나타난 높은 봉우리의 면적, 1218.2862값을 y에 대입해보면, x==84.170753... 이다. 따라서 미지의 용액 속 caffeine의 농도는 84.2M 라고 추정할 수 있다. (최대 높이의 봉우리를 택한 이유는 커피에 caffeine외의 물질도 있어서 검출될 수 있지만 앞의 두 표준용액의 시간과 거의 비슷한 시간인 2m56s 경에 최대 봉우리가 나타났기 때문이다) 그리고 커피를 10배 묽힌 용액을 사용하였으므로 실제 커피 농도는 842M 이 될 것이다. 한편 caffeine의 분자식 C8H10O2N4에서 분자량을 구하면 12.01×8+1.008×10+ 16.00×2+14.01×2=194.2 이다. 따라서 우리가 알고 싶은 100mL 당 caffeine의 mg은
x (mg)/100mL = 842㎛×194.2g/mol 이고, 방정식을 풀면
x = 842M×100mL×194.2g/mol
= 16351640mg = 16.351640mg
⇒ 16.4 mg (유효숫자 3자리 처리)임을 알 수 있다. 그리고 handout을 보면 두 티스푼, 즉 700mg의 커피를 녹였다고 하였으므로, 동결전조 커피에 들어있는 caffeine의 무게 퍼센트는
(16.4mg/700mg)×100%=2.34% 이다. (6번 항목)
이번실험에서는 자동화된 고성능 장비와 조교님이 미리 준비해주신 시약 때문에 특별한 어려움은 없었다. 다른 실험에 비해서 분석하기 좋은 결과도 얻을 수 있었다. 다만 다소 어려웠던 점은 Hamilton syringe에 정확한 용량의 용리 액을 넣는 것이었다. 기포는 분석결과에 영향을 미칠 수 있어서 제거해야 했는데, 기포제거가 생각보다 쉽지 않아서 애를 먹었다. 그리고 Hamilton syringe가 워낙 적은 양의 액체를 담다보니 80㎕를 정확히 맞추는 것이 다소 힘들었다.
그리고 실험 전반에 걸쳐 상대적으로 작은 봉우리 값은 우리가 의도하지 않은 미세·미량의 물질이나 기기에서 발생한 오차에 의한 것이라고 생각하고 무시하였다. 다만 커피의 경우 RT값이 1.6267일 때 다소 높은 흡광도 값이 측정되었는데, 이것은 커피에 자연적으로 다소 많이 들어있는, caffeine이 아닌 다른 물질이 caffeine과 비슷한 RT값ㅇ에서 높은 흡광도 값을 가질까봐 염려하였지만 다행히 그런 물질은 검출되지 않았으며 표준용액 100M, 200M에서의 caffeine의 RT값과 거의 일치하는 RT값에서 커피용액의 caffeine이 검출되었다.
실험에 사용된 기기가 정밀한 만큼 조그마한 이물질(의도하지 않은)도 detector에서 측정될 수 있다는 점에서 만약 시간이 허락되었다면, 정량문석 실험에서 표준용액을 조금 더 다양하게 하여 (예를들어 10,100,150,200M) 측정해보았더라면 좋았을 것이라는 생각이 든다. 그렇게 하면 확률·통계적으로 조금더 참값에 가까운 standard curve를 얻어서 더 정밀한 예측을 할 수 있었을 것이다. (7번 항목) 초한 예측 후에는 그 농도의 caffeine용액을 직접 만들어 그것의 크로마토그램에서 얻은 caffeine의 면적 값과 미지의 커피용액의 크로마토그램에서 얻은 caffeine의 면적 값을 비교해 보는 것도 좋을것이라는 생각이 든다.
REFERENCE
① 이대문, “크로마토그래피”, 민음사, 1991, 머리말
②④⑦ 박창일·이지호, “HPLC의 이론과 실제”, 자유아카데미, 1993, p.1-2, 79-80, 17-30
③⑤⑨ D.A.Skoong외, 권수한외 역, “분석화학”, 6/ed, 탐구당, 1998, p.589,455-461,570
⑥⑧ L.R.Snyder·J·J·Kirkland, Introduction to modern liquid chromatography, 2/ed, Wiley-Interscience, 1979, chap6, (박창일·이지호, “HPLC의 이론과 실제”, 자유아카데미, 1993, p.24에서 재인용, p.23에서 재인용)
⑩ D.C.Harris, 김강진외 역, “최신분석화학”, 2/ed, 자유아카데미, 2004, p.5-6

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액체,   크로마토그래피,   카페인,   분석,   HPLC