세포생물학-Isolation of genomic DNA

본문내용

이번 실험에서는 genomic DNA 추출을 하였다. 배추잎을 급속 냉각시켜 분쇄 후 DNA를 추출하였다. DNA추출은 세포를 유리시키고, 배양세포는 배양기에서 분리하며, 이러한 세포의 세포벽과 세포막을 파괴하고, 세포중의 단백을 변성시켜 제거하고, 그 후 RNA 분해시켜 마지막으로 DNA를 추출한다. 어떤 경우에도 단백 성분의 제거와 조작중에 첨가되는 염류(salt)를 제거하지 않으면 DNA의 효소처리에서 억제작용이 일어나므로 주의를 요한다. 배추잎을 가위로 잘게 자르고 곧 액체 질소에 넣어 동결하나, 이번실험에는 sample을 -70℃에 넣어 동결시켰다. 동결을 신속히 해야하는데 이것은 세포중의 nuclease 활성에 의해 DNA의 절단을 막기 위함이다. 동결한 조직을 차게한 유발에서 부수거나, 혹은 조직분쇄기(호모지나이저)를 사용하여 세포를 분쇄한다. CTAB은 cetultrimethyl-ammonium bromaid이며, 이를 첨가함으로 인해 핵산 복합체를 형성되어 침전한다. RNase A는 RNA를 제거하기위한 조작이다. RNase를 첨가하고 65℃에서 5분 정도 incubation을 하면 RNA를 분해시킨다. 그 후에 첨가된 chloroform은 상등액의 DNA층이 분리하기 쉬워지게끔 해준다. 유기용매로서 DNA층과의 구분을 지어줘 쉽게 채취 할 수 있도록 해준다. 이러한 chloroform은 isoamyl alcohol을 24:1의 비율로 혼합하여 사용한다. 그 후 다른 세포 구성물질로부터 DNA만을 분리해 내는 작업하는데 이러한 역할을 하는 물질이 isopropanol이다. 세포 추출물에 isopropanol을 가하고 -20℃ 이하에 방치하면 DNA와 RNA가 함께 침전 된다. 상등액을 제거하고 RNA분해효소가 함유된 TE로 처리를 하면 DNA는 수용액 중에 녹아 있고, RNA는 제거 된다. 실험중간에 있는 centrifuge 주의를 요한다. centrifuge 중심을 맞추기 위해 서로 시료가 든 튜브를 같은 위치에 반대에 위치시킨다. 그리하여야만 centrifuge 동일한 원심력을 적용할 수 있다. 또한 centrifuge 시료가 든 튜브의 마게 부위의 튀어나온 부위를 바깥쪽으로 해야한다. 그리하여야 DNA가 튜브벽에 생기고 남은 사용하지 액체들을 버릴 때 쉽게, 정확히 버릴수 있기 때문이다. 그리고 70%의 EtOH은 상등액을 제거한 후 튜브에 넣어 세척하기 위함이다. 그 후 바로 centrifuge를 해야하지만 DNA의 추출이 너무 적어 -20℃에서 10분간 incubation을 시킨다. 그러고 나면 DNA추출이 더 많이 일어남을 알 수있다. 그 후 centrifuge를 하는데 그 이후에는 어떠한 충격도 튜브에 주어서는 안된다. centrifuge 이 후에 넣었던 상층액을 제거하면 이로써 genomic DNA 추출이 완전히 된 것이기 때문이다. 그리하여 상등액을 제거 후 튜브에 붙어 있는 DNA추출이 떨어지지 않도록 하고 튜브를 돌리지 않은 상태로 자연건조를 시킨다. 열건조나 air-drying이 가능하나 추출된 양이 얼마 되지 않아 DNA 손실을 최소로 하기 위하여 자연건조를 시키는 것이다. 마지막으로 증류를 넣은 후 water bath에 20분 놓는다. 이는 DNA추출을 녹여주기 위함이다. 그 뒤 -20℃에서 보관하였다. 단기로 바로 사용시에는 4℃에 보관하여도 되나 우리의 실험은 장기간 이용할 것으로 장기 보관을 위하여 -20℃에서 보관을 하였다.
*Reference
유전자진단의이론과실체/김영설, 이홍규/도서출판한의학/1999/P29~P33
분자생물학노트/한국과학기술연구원생명공학연구소/한림원/1998/P33~P40, P69~P77

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