[생명과학,유전공학,분자생물학] 분자생물실험워크북

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본문내용

A. 제한효소를 이용한 DNA의 절단
제한효소 1 unit는 1 μg의 DNA를 최적 온도에서 한 시간에 절단할 수 있는 양이다. 상품화된 효소는 효소마다 다르지만 대개 10 units/μl 내외의 농도로 공급된다.
제한효소 처리 반응은 절단하려고 하는 DNA, 반응완충용액, 제한효소로 구성된다. 각각의 성분에 대하여 다음과 같은 점들을 고려하여야 할 것이다.
1) 자를 DNA 내에 제한효소로 잘리는 부위가 몇 개가 되는지 파악한다. 같은 양의 DNA에 제한효소 절단부위가 무수히 많을 수도 있고 없을 수도 있으며, 이들 경우에 같은 양의 효소작용을 기대할 수 없을 것이다. 그러나 보통 실험에서는 계산된 양보다 더 많은 효소를 넣어주기 때문에 그다지 걱정할 필요는 없다.
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실험방법
1. 미세 원침관에 micropipette으로 다음과 같이 넣는다.
절단하고자 하는 DNA 5 μg
10x 반응완충용액 2 μl
BamH I 제한효소 (10 units/μl) 1 μl
증류수 up to 20 μl
* 위와 같은 혼합물을 시험관에 넣을 때에는 보통 효소를 가장 마지막에 넣는 것이 좋다.
* 효소 원액에는 glycerol이 들어있기 때문에 점도가 높아서 pipetting할 때 tip 끝만 살짝 담구어서 덜어내어야 tip 주위에 효소가 많이 뭍어나오는 것을 막을 수 있다. 또한 효소량이 반응 총액의 10%를 넘으면 효소 활성이 glycerol에 의해 억제될 수 있기 때문에 주의해야 한다. 총 부피는 대개 20 μl로 한다.
* 효소는 -20°C에서 50% glycerol이 들어있는 완충액내에서 안정하게 존재하므로 반드시 냉동실에 보관하고 실온에 노출되는 시간을 가능한한 줄인다.
2. 기포가 생기지 않게 주의하면서 섞는다. 섞는 방법은 pipette을 up-down하는 방법, 손가락 끝으로 가볍게 툭툭 치는 방법(tapping), 부드럽게 vortex하는 방법 등이 주로 쓰인다. 심하게 vortex하지 않는다.

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