[생화학 실험 최종 레포트] 유전자 재조합 단백질 정제 및 분석 - Cell culture, Bradford, SDS PAGE, Affinity chromatography , UV 흡광도 과정 및 결과 이론

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[생화학 실험 최종 레포트] 유전자 재조합 단백질 정제 및 분석 - Cell culture, Bradford, SDS PAGE, Affinity chromatography , UV 흡광도 과정 및 결과 이론 에 대한 보고서 자료입니다.

목차

유전자 재조합 단백질 정제 및 분석


Ⅰ 서 론(이론)
　1. Cell culture
　2. Harvest
　3. Protein purification
　4. Dialysis
　5. Bradford
　6. SDS PAGE

Ⅱ 실 험
　1. Cell culture
　　1.1 LB 배지 만들기
　　1.2 1,2차 Seeding
　2. Harvest
　　2.1 Harvest
　　2.2 Cell lysis
　3. Protein purification
　　3.1 Buffer 만들기
　　3.2 Affinity chromatography packing
　　3.3 Sample 준비
　　3.4 Sample loading
　　3.5 Resin washing
　　3.6 Sampling
　4. Dialysis
　　4.1 Buffer 만들기
　　4.2 1,2 차 Dialysis
　5. Bradford
　　5.1 Bradford
　　5.2 UV spectrophotometry
　6. SDS PAGE
　　6.1 PAGE gel 조성 및 준비과정
　　6.2 PAGE 만들기
　　6.3 Loading
　　6.5 Staining , Destaining , Dry

Ⅲ 결 과
　1. Cell culture
　2. Bradford
　3. UV assay
　4. SDS PAGE

Ⅳ 토 의

Ⅴ 참고문헌

본문내용

우 UV 는 2.0 이 나왔다. Mus musculus PDI 의 정보이며 람버트 비어 법칙에 의하여 A=εlC 에 대입한다.
12)
사진 4. PDI ε 및 분자량
를 통해 ε=51255 , 분자량 57058.4 g/mol 임을 알았다.
2.0=51255*C C = 0.00003902058 mol/l 이 값에 분자량을 곱하면
2.22645205346 g/l 가 나왔다.
4. SDS PAGE
사진 5. SDS PAGE 결과
순서는 Induction x total , Induction o total , Induction sup , Induction pellet , FT , E 이였으며 각각의 상태를 해석해보면 Induction x total 의 경우 정상 Protein 상태라 볼 수 있으며 Induction o total 은 target Protein 인 PDI 가 과발현 된 상태이고 Induction sup 은 비교적 가벼운 Protein 들의 존재이다. Induction pellet 은 sup 과반대로 비교적 무거운 Protein 들이며 FT 의 경우 Ni 과 affinity 가없는 Protein 이고 E 의 경우 Ni 과 affinity 가 있는 즉 PDI 라 보면 된다. E에서 PDI 값은 약 45kDa 보다 상위에 있는 값이 나왔으며 자료상 509 aa (55.99 kDa) 대략 비슷한 값이 나옴을 알 수 있다.
Ⅳ 토 의
O.D 값이 1을 넘으면 신뢰성이 떨어지는 이유는 람버트 비어법칙(A=εlC)에서 찾아볼 수 있었다. A(흡광도)=LogI0/It 로 나타 낼 수 있으며 즉 A는 Log 함수를 따른다. log 함수는 선형이 아닌 곡선형이고 x 값이 증가 할수록 y 값은 완만한 값이 나온다. 그러므로 y 값인 흡광도가 높게 나온다면 x 값의 오차범위는 매우 커짐으로 신뢰성이 떨어질 수 있다.
이론 상 UV assay 와 Bradford 를 통한 Protein 정량법은 비슷하게 나왔어야 했으나 실험 상 Bradford 는 0.7435 μg/μl , UV 는 2.22645205346 g/l 라는 엄청난 차이가 생겼다. 이유로는 Bradford 의 경우 positive charged 에 결합하기 때문에 basic amino-acid 인 arginine 이 필요하다. UV 의 경우 방향족 고리를 지닌 Tyr의 phenol 과 Trp 의 indole ring 이 필요하다. 이렇게 측정하는 기준점이 약간 달라 오류가 있고 또한 실험에 사용한 PDI(E)은 Sample buffer 에 있던 것으로 Sample buffer 의 ring group 에 의한 차이도 있었다.
또한 UV 와 Bradford 가 차이나는 이유 중 Bradford 검정곡선 오류도 생각해볼 수 있다. 이를 해결하기 위해서는 검정곡선을 더 명확하게 만들어야 되는데 이는 실험과정을 더 명확하게 하는 것 과 검정곡선의 신뢰도인 R^2 값을 더 높여주면 된다. R^2 값을 높여주기 위해서는 Control 이 되는 BSA 를 2,4,6,8,10 보다 더 많은 부분으로 나눠 측정하면 된다.
SDS PAGE 결과 사진을 보면 약간의 휘어짐이 보인다. 이 휘어짐의 이유로는 Well 이 일정하지 않아서, gel 의 문제 , Protein 의 문제 등을 생각 할 수 있다. 이 중 Protein 의 문제는 PDI 의 크기 값이 제대로 나왔기 때문에 제외하고 Well 문제의 해결책으로는 Comb 를 뺄 때 수직으로 빼 Well 의 중단과 하단의 크기다 같게 하거나 Well 내의 이물질을 없애고 gel 의 문제는 조성을 제대로 섞고 Shaking 해주면 해결될 것이다.
Ⅴ 참고문헌
1) http://en.wikipedia.org/wiki/Ampicillin
2) http://cms.daegu.ac.kr/sgpark/molecular%20biology/%EC%9B%90%ED%95%B5%EC%84%B8%ED%8F%AC%EC%9D%98%20%EC%A0%84%EC%82%AC%EC%A1%B0%EC%A0%88.htm
3) http://www.genehunters.co.kr/Training/01_3_2.htm
4) [네이버 지식백과] 트리스 [tris] (생명과학대사전, 2008.2.5, 아카데미서적)
5)http://ko.wikipedia.org/wiki/%ED%81%AC%EB%A1%9C%EB%A7%88%ED%86%A0%EA%B7%B8%EB%9E%98%ED%94%BC
https://www.cheric.org/ippage/e/ipdata/2001/12/file/e200112-801.pdf
6)
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=610654&cid=42420&categoryId=42420
7) http://en.wikipedia.org/wiki/Bradford_protein_assay
8)
http://www.google.co.kr/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&cd=1&ved=0CCIQFjAA&url=http%3A%2F%2Fbiochem.yonsei.ac.kr%2Fboard%2Flib%2Fdown.php%3Fboardid%3Dboard_assistant_test%26no%3D7%26num%3D1&ei=C-x9VI2HEMKxmAWHlYCgDQ&usg=AFQjCNGQsAyJf7b242ZwoKvhbLk8-jD0ww&bvm=bv.80642063,d.dGY&cad=rjt
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=425229&cid=42411&categoryId=42411
9)
http://kbp.donga.ac.kr/xanta%EB%85%B8%ED%8A%B8/2012/2012-2/12-2-bioanal(exp)/11-2-bioanal-exp-8.htm
10) http://en.wikipedia.org/wiki/Protein_disulfide-isomerase
11) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/P09103.2
12) http://web.expasy.org/cgi-bin/protparam/protparam

키워드

Cell culture,   Bradford,   SDS PAGE,   Affinity chromatography,   UV 흡광도,   Cell,   유전자 재조합 단백질 정제