분자생물학 실험 Ligation & Transformation

소개글

분자생물학 실험 Ligation & Transformation에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Introduction
2. Materials
3. Methods
4. Results
5. Discussion
6. Reference

본문내용

ator에서 250rpm, 40분 반응시킨다.-2. 반응시킨 tube를 1000rpm, 3분 centrifuge하여 80 ㎕정도 제거하고 남은 sup.에 pellet을 잘 푼다.
LB agar 각 plate당 50 mg/ml X-gal 16 ㎕, 0.8 M IPTG 1 ㎕, 50 mg/ml ampicillin 20 ㎕ + LB 30 ㎕를 spreading하여 30분간 기다린다.
를 plate에 spreading한다.
Plate를 37˚C에서 16~24시간 incubation한다.
각 plate의 blue/white colony 형성을 관찰한다.
Results
1:3 1:4
positive background
Discussion
이번실험은 지난 시간에 제작한 competent cell의 DNA에 PCR product를 삽입한 후 ligation 및 transformation하는 과정이었다. 지난 시간에 결과로 나왔던 PCR product를 insert로 넣었기 때문에 조마다 양을 다르게 하여 ligate를 만들었다. 우리조의 insert 농도는 7.88 ng/ul 이었는데, insert size와 vector size의 관계를 비교해서 적정한 insert 양을 구하는 계산은 molar ratio로 vector : insert = 1:3 ~ 1:5 였는데, 우리는 1:3과 1:4로 각각 계산하여 필요한 양만큼을 적정했다.
vector : insert 의 molar ratio가 1:1일 경우
3 Kb : 0.34 Kb = 50 ng : X ng
∴ X = 5.67 ng
-1:3 일 때,
5.67 ng × 3 = 17.01 ng
∴ 필요한 부피 = 17.01 ng ÷ 7.88 ng/ul ≒ 2.15 ul
-1:4 일 때,
5.67 ng × 4 = 22.68 ng
∴ 필요한 부피 = 22.68 ng ÷ 7.88 ng/ul ≒ 2.88 ul
그 다음 이렇게 만든 ligate를 competent cell과 혼합한 후 heat shock을 줘서 DNA를 세포 내부로 흡수시키고 antibiotics 저항 유전자가 발현되도록 한 후 X-Gal, IPTG, ampicillin처리된 배지에 spreading하고 incubation시켰다.
하지만 위 결과에서 보다시피 positive control 배지에만 blue colony가 약간 생기고 나머지는 colony가 형성되지 않았다. 대신 약간의 satellite cell들이 존재하는 것으로 보아 colony가 생겼다가 사라진 것일 수도 있다. 그게 아닐 경우 colony 자체가 별로 형성되지 않은 것은 아마 competent cell의 제작 과정에서 문제가 있었던 것 같다.
*satellite colony
= antibiotics resistant colony 주위에 자라는 작은 colony로 antibiotics resistant colony가 antibiotics를 분해하는 enzyme을 분비하기 때문에 주위의 transformation되지 않은 다른 bacteria들이 자라서 작은 colony를 형성

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