Plasmid Purification & DNA 전기영동 (예비보고서)

소개글

Plasmid Purification & DNA 전기영동 (예비보고서)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

♦ 실험 목적
♦ 실험 원리
♦ 시약 및 기구
♦ 실험 방법
3. 시약 및 기구

본문내용

조각을 감지하기가 어렵게 된다. 이렇게 되는 경우에는 gel을 ethidium bromide가 0.5 μg/ml 포함된 증류수나 1x TAE 용액에 30∼45분간 담가 염색하였다가 관찰하면 된다.
- 파장 254 nm에서의 자외선 : DNA에 흡수되어 색소에 전달
- Ethidium bromide는 단일가닥과 이중가닥 DNA및 RNA 검색에 모두 사용할 수 있으나 염료의 친화성이 단일가닥에서보다 이중가닥에서 더 강하다.
전기영동 buffer
- TAE( Tris acetate EDTA)
DNA 분자량이 큰 경우 agarose electrophorsis에서 쓰임. (>12kb)
너무 반복해서 사용할 경우 DNA band가 smear해 질 가능성.
- TBE (Tris borate EDTA)
DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰임. (<1 kb)
TBE는 좀 더 오래 사용가능. buffering capacity가 더 좋기 때문.
- gel을 만들 때 사용되는 물질들을 완충용액(Buffer)에 녹여야 한다.
: 일정한 ionization state 를 제공하기 위해서
분석물질이 전하를 띄고 안정한 정도의 PH 유지
-전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용
: 이온 강도 또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 크게 영향을 주기 때문
Size Marker
: 단백질이나 DNA를 전기영동 할 때 우리가 전기영동 한 sample의 size를 알기 위해 이미 알고 있는 size들을 모아 standard로 사용하는 것
Loading buffer
- 보통 6x를 사용분자량이 큰 glycerol 등 무거운 물질이 함유되어 있어서 아가로즈의 well에 DNA를 넣어 줄때 DNA 용액을 무겁게 하여 아래로 가라앉히는 역할 .
- 파란색을 내는 bromophenol blue가 들어 있어서 전기영동하는 동안에 진행상태를 눈으로 보아 알 수 있게 한다.
실험방법
1> DNA 전기영동기를 ethanol로 세척한다.
Agarose Gel 만들기
2> 분리 하고자 하는 DNA의 크기에 따라 적절한 %의 Agarose를 저울로 잰다. (보통 0.5 ~ 1.5 % )
3> 전자레인지에 데워서 녹인다.
(1분 정도 ; 끓게 되면 농도가 달라지므로 주의한다.)
매우 뜨거우므로 반드시 장갑을 착용해야 한다.
4> Agarose gel을 식힘(60도)
5> Gel cast에 gel을 붓고 comb를 꽂음. comb은 시료를 넣을 공간을 마련한다.
- comb은 주형의 밑바닥으로부터 0.5~1.0mm 정도 위치에 둔다.
- gel의 두께는 3~5mm 정도로 한다. 두께가 너무 얇으면 찢어져서 sample이 샌다.
- comb를 꽂았을 때 기포가 생기지 않도록 주의 한다.
6> Agarose가 굳을 때까지 기다린다. (약 15분)
Gel electrophoresis
7> gel이 굳으면 comb을 제거하고 electrophoresis tank에 gel판을 옮긴다.
8> 전기영동 tank에 running buffer(1x TAE)를 gel을 1mm정도 두께로 덮도록 채운다.
전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. 이온강도 또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 크게 영향을 주기 때문이다.
9> DNA sample 을 loading buffer 와 섞어 준다.
(sample DNA 20μl+ 6X loading buffer 4μl)
10> 홈(well) 에 maker 와 sample 을 넣는다.
11> 100V 전원을 연결 .
- 전기장의 방향에 주의하여 전기영동 장치에서 젤의 먼 쪽이 양극이 되게 한다.
12> 전기영동
전기영동을 시작하면 전기분해에 의하여 양극과 음극에서 기포가 발생하고 시약에 섞인 염료가 홈으로부터 이동해가는 것이 보인다.loading 염색약(bromophenol blue dye,파란색)이 gel에서 빠지지 않도록 주의한다. 겔이 중간 쯤 가는 정도가 적당하다. 감전에 주의한다.
DNA 염색(EtBr) & 관찰
12> 전개 후 gel을 후드 속의 EtBr용액에 10분간 담근다.
- EtBr은 빛에 약하며 또한 발암물질이므로 주의한다. 용액을 사용할 때 비닐장갑을 꼭 착용해야 한다. 잘못하면 유전자 돌연변이가 일어 날 수도 있다. DNA 2.5b.p당 한 분자의 EtBr끼어 들어간다.
13> Gel을 꺼내어 세척용액(증류수)에 세척한다.
14> UV transilluminator로 확인한다.
- DNA와 결합한 EtBr은 형광을 강하게 나타내기 때문에 band가 보이는 것이다.
- 1차 : 254nm →(DNA) 302, 366nm
2차 : →(EtBr) 590nm에서 re-emit (red-orange)
따라서 DNA와 결합하지 않은 EtBr보다 20～30배 형광을 나타낸다.
(background에 free EtBr이 존재하는 상황에서 DNA 10ng만 있어도 band 관찰 가능)
- 보통은 불필요하나 background를 조금이라도 줄이고 싶으면 추가로 Gel을 증류수나 적당한 buffer에 10～20분 정도 담궈서 DNA와 결합하지 않은 EtBr을 제거하는 것이 도움이 된다.
- EtBr 이외에 훨씬 더 민감한 형광염색 시약도 있으나 고가이므로 특별한 경우가 아니면 잘 사용하지 않는다. ( SYBR gold의 경우 20pg도 가능)
15> 사진을 찍어 결과를 분석(폴라로이드 카메라 또는 Imaging System(CCD카메라))
※ agarose gel을 만들 때 EtBr을 넣으면 염색과정이 필요 없다.
장 점
단 점
절차가 간소해 진다.
전기 영동시 UV를 비춰 DNA의 이동을 바로 확인할 수 있다.
DNA의 이동속도가 15% 늦어진다.
전기영동시 EtBr이 없으면 Sharp한 band를 얻을 수 있다.
DNA의 형태에 따라 EtBr의 결합정도가 달라져서 natural한 pattern을 보기 어렵다.
전기영동 tank 및 gel tray가 EtBr에 오염된다.
단, 그 차이는 그리 크지 않으므로 실험실마다 선호하는 방법이 다르다.

키워드

Plasmid Purification & DNA 전기영동 (예비보고서),   구배원심분리법,   염색체,   예비보고서