(화공종합설계)amylase 최적 생성을 위한 각 host를 사용한 공정 설계

소개글

(화공종합설계)amylase 최적 생성을 위한 각 host를 사용한 공정 설계에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1 서론 /6
1.1 α-Amylase
1.2 E. coli
1.3 S. lividan
1.4 Structure of cells and release area

2 본론 /21
2.1 E. coli A /21
2.2 E. coli B /47
2.3 S. lividan A /69
2.4 S. lividan B /87

3 결론
3.1 최적 Route 별 경제성 분석 및 최종 공정 도출 /101
3.2 민감도 분석 /105
3.3 특정 상황을 가정한 이윤 분석 /108
3.4 최종 결론 /113

4 참고 문헌 /115

본문내용

1.Fermentation
선택한 균주 Recombinant E. coli strain BL21가 Biomass를 생합성하며 그 개체 수를 늘리기 위하여 media를 발효기에 공급하여 최적의 조건서 발효시킨다.
2.Direct Chemical Extraction
생합성 된 Biomass를 extraction buffer를 이용하여 부수어서 amylase 등 기타물질을 얻는다.
3.Centrifugation
Suspension viscosity 감소를 위해 Cell debris와 DNA-PEI complexes를 제거한다.
4.IEX-EBA Chromatography
chromatography하기 앞서 loading하는 용액이 equilibration 단계의 buffer A와 같은 조건이 되도록 diafiltration step을 거친다. Chromatography는 buffer A로 equilibration 시킨 후 발효 액을 loading 한다. Elution 시켜주기 위해 0.2 M의 NaCl 등 eluant buffer를 5bed volumes으로 흘려준다. 마지막으로 재활용하기 위하여 1M NaCl buffer로 regeneration 시켜준다.
5.Crystallization
Chromatography 통하여 target 물질인 α-Amylase를 추출하였는데 이를 Crystallization 과정을 통하여 분순물과 물을 제거하여 상품 가치를 갖춘 높은 수율의 amylase-crystallization을 만들어낸다.
2. 공정 상세 설명
1. Fermentation
[ Condition ]
E. coli JM107 pQRl26는 목적물 α-Amylase 을 생산 하는데 가장 적합한 균주이다. 이 균주는 Glycerol를 영양분으로 하여 아래의 반응식과 같이 Biomass(CH1.8O0.5N0.2)를 생산한다.
pGlycerol + qO2 + rNH3 → xBiomass + yH2O + zCO2 ( Eq. 1 )
발효는 100KL 발효기에서 37℃에서 18시간 동안 배양을 하는데 이 때 생산되는 양은 참고논문의 실험 결과를 참고하여 계산하였다. 발효기에 feeding 되는 Glycerol과 ammonia는 각각 carbon과 nitrogen source로 공급되고 oxygen은 생합성을 더욱 활성화 하기 위하여 0.5vvm으로 compressor에 의해 공급된다.
[ Material balance ]
100kL fermentor의 working volume 값을 80KL(80%)로 잡았다. Glycerol을 비롯한 반응물들이 유입되어 목적물을 생산하는데 fermentor가 넘치지 않도록 하는 최대 값을 잡았다. Eq. 1의 반응 계수를 구하기 위하여 각 물질의 분자식을 기초로 하여 양론식을 세워 아래와 같이 각 물질의 반응 계수를 구하였다.
2. Chemical extraction
[ Condition ]
발효가 되어 나오는 발효액은 extraction buffer에 의하여 25℃ 1hr 조건의 stirred reactor에서 화학적 추출을 한다. 추출은 두 단계로 이루어 지는데 첫 단계는 extraction buffer를 통해 화학적 반응을 일으켜 직접적으로 세포를 깨는데 그 결과 아래 식과 같은 목적물이 나온다.
목적물로 나오는 DNA는 cell lysates의 점성을 높여서 후에 downstream processing 과정에서 생산물의 원하는 yield를 얻는데 어려움을 겪게 된다. 따라서 아래 Eq. 3와 같이 PEI(polyethyleneimine)가 extraction buffer에 첨가되어 DNA-PEI complex로 선택적 침전을 일으킨다. 단 침전 율은 100%이다. 그리고 Final extraction buffer는 0.1 M Tris, 3 mM EDTA and 1% (w/v) PEI at pH 9.0 이다. 여기서 EDTA는 Biomass를 깨는 역할을 Tris는 완충역할을 한다. Reference 1(이후 Ref 1.) 논문의 실험데이터를 전적으로 참고하였다. 우선 왼쪽 데이터에서 Periplasmic과 세포전체에서 각각 나오는 α-Amylase의 양을 정량적으로 비교할 수 있었다. 그리고 아래 데이터를 통해서 일정한 배지 조건에서 생산되는 전체 단백질(50%)을 구해냈고 나아가 α-Amylase(8.7%)의 조성비율까지 찾아냈다. 따라서 Eq. 2는 각각 α-Amylase(8.7%), CPs(41.3%), cell debris(49%), DNA(1%) 임을 구하였다. DNA-PEI complex를 효율적으로 제거 하기 위하여 원심분리를 한다.

키워드

superpro designer,   amylase,   화공종합설계,   화학공장