중합효소연쇄반응 PCR (Polymerase Chain Reaction)_예비레포트 [A+]

소개글

중합효소연쇄반응 PCR (Polymerase Chain Reaction)_예비레포트 [A+]에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 실험 목적
2. 바탕 이론
3. 기구 및 시약
4. 실험 방법
5. 참고 문헌

본문내용

(Plasmid) 는 생장에 필수적인 염색체 (Chromosom) DNA에서 물리적으로 분리되어 있는 대표적인 에피솜 DNA 분자이다.
⑤ Nuclease free water
⑥ Forward primer, Reverse primer
Fig 12 . Nuclease free water
- 핵산 실험을 할 때, 문제되는 핵산을 포함하고 있지 않은 초순수 상태의 물이다.
Fig 13. Forward primer, Reverse primer
- DNA 합성의 시작점이 되는 짧은 유전자 서열로. DNA가 두 가닥이므로 forward primer와 reverse primer 두 종류의 프라이머가 사용된다.
⑦ Pfu polymerase
⑧ Electrophoresis apparatus (전기영동장치) &
Electrophoresis agarose
Fig 14. Pfu polymerase
- DNA를 중합하는 과정에 필요한 효소로, PCR의 과정에서 가열과 냉각이 반복되기 때문에 90°C 이상의 고온에서도 활성을 잃지 않는 효소를 사용한다. DNA의 5’에서 3’ 으로 합성하고, 3’에서 5’ 으로 잘못된 염기를 교정하는 능력을 가지고 있다.
Fig 15. (왼쪽) Electrophoresis apparatus
Fig 16. (오른쪽) Electrophoresis agarose
- Electrophoresis apparatus은 전기영동을 하는 기기이고, DNA의 크기가 클수록 느리게 이동하게 된다.
Agarose Gel은 젤화 경향이 센 다당류의 하나로 생체 물질을 분리하는 여과제로 사용된다.
⑧ 1 kdp DNA ladder
(= Size marker)
⑨ DNA loading star (6X)
Fig 17. DNA ladder
- 샘플의 크기를 알기 위한 기준으로 사용되는 시약으로, 첫번째 홈에 로딩하여 측정하고자 하는 DNA의 크기를 비교하는데 사용된다.
Fig 18. DNA loading star
- DNA와 결합해서 agarose gel 상에서 DNA의 위치를 파악하게 해주는 염색약이다. 파란색을 띠기 때문에 전기영동을 하는 동안 눈으로 확연하게 진행 상태를 확인할 수 있다.
⑩ UV transilluminator
⑪ TAE buffer (1X)
Fig 19. UV transilluminator
- TLC 또는 electrophoresis 실험에 있어서 cell의 검출 목적 등에 이용되며, 특정 파장의 UV를 조사하여 형광을 일으키므로 투명성과 UV intensity가 탁월하기 때문에 electrophoresis 실험 시 미량의 DNA도 검출할 수 있다.
FIg 20. TAE buffer
- Tris Acetate, EDTA Buffer이며 전기 영동시 DNA가 양극으로 이동할 때 운반체의 역할을 해준다. Tris는 양이온을 공급해 음전하를 띠는 DNA를 끌어주고, Acetate는 Tris의 높은 pH를 낮춰 DNA의 손상을 억제한다. 마지막으로 EDTA는 DNase의 마그네슘 이온을 억제해서 전기영동을 하는 동안 DNA가 변질되는 것을 방지한다.
※ 실험 시 유의사항
- 의 온도조절에 유의한다. 가 너무 높으면 프라이머가 주형 DNA에 너무 약하게 결합되어 PCR산물의 양이 너무 적고, 가 너무 낮으면 프라이머가 비특이적으로 결합해 원하지 않는 DNA가 증폭될 수 있기 때문이다.
- 핵산 분해효소는 손이나 땀 등에도 있기 때문에 혼입을 막기 위해 장갑과 마스크를 반드시 착용해야 한다.
- 사용하는 tube와 피펫 팁, 용액 등은 멸균해 핵산 분해효소를 불활성시켜둬야 한다.
4. 실험 방법
< PCR mixture >
Total 50 μl
DNA template
2 μl
Nuclease free water
12.5 μl
Forward primer
(T7 primer)
10 μl
Reverse primer
(T7 terminator primer)
0.5 μl
pfu master mix
25 μl
(1) 위의 레시피대로 PCR mixture를 만든다. 이 때, 시약은 위에서부터 순서대로 넣는다.
(2) PCR thermocycler의 온도를 다음과 같이 설정하여 PCR을 진행한다.
(약 50분 소요)
< PCR thermocycler Setting >
94℃ 3 min
94℃ 30 sec (Denaturation) ┓
52℃ 30 sec (Annealing) x 11 cycle
72℃ 1 min (Polymerization) ┛
72℃ 5 min
(3) 전기영동 기기에 Agarose gel을 넣고 1X TAE buffer를 잠길 때까지 채운다.
(4) 1kbp DNA ladder와 6X Loading star를 섞어 Agarose gel의 첫 번째 홈에 loading 한다.
(5) PCR 샘플과 6X Loading star를 섞어 두 번째 홈에 loading 한다.
(6) 100 V의 전압에서 1시간 동안 전기영동을 실시한다.
(7) Agarose gel을 꺼내 UV transilluminator 위에 놓고 UV를 쬐어 PCR의 결과를 확인한다.
5. 참고 문헌
- Touchdown PCR for increased specificity and sensitivity in PCR amplification. Korbie, D.J., Mattick, J.S. Nat Protoc.,3(9): p. 14521456 (2008).
- Principles and Technical Aspects of PCR Amplification. Pelt-Verkuil, E.V, Belkum, A.V., Hays, J. P.. Springer Science &Business Media,Mar 14, (2008)
- David L. Nelson, Michael M. Cox. Lehninger Principles of Biochemistry (6th edition) W. H. Freeman. (2012)
- [네이버 지식백과] DNA [deoxyribonucleic acid] (미생물학백과)
DNA의 복제 , 중합효소 연쇄반응 (PCR) (생화학백과)

키워드

생물화학공학,   화학공학,   화학공학실험,   생물실험,   예비레포트,   실험이론,   PCR,   중합효소연쇄반응