<실험>WESTERN BLOTTING

소개글

<실험>WESTERN BLOTTING에 대한 보고서 자료입니다.

목차

Ⅰ. Introduction

Ⅱ. Materials ＆ apparatus

Ⅲ. Mathod
1. Protein purification
2. SDS-PAGE
3. Transfer into nitrocellulose membrane ＆ western blotting

Ⅳ. Result

Ⅴ. Discussion

Ⅵ. Reference

본문내용

의 부착능력이 더 우수하다. 또 polyvinylidene difluoride(PVDF)는 nitrocellulose와 nylon보다 상대적으로 화학적 저항성과 기계적 힘에 있어서 우수하다. 다른 막들은 단백질과 peptide에 공유결합을 함으로써 단백질이 이동하게 되는데 면역분석(immunoassay)에 많이 이용된다.
Membrane은 buffer에 녹이면 물에 젖지 않는다. 재질적 특성 때문에 methanol을 추가하여야 한다. protein과 membrane의 친화력을 높이기 위해서 methanol이 추가되어야 한다. 반면에 nitrocellulose membrane은 그냥 buffer에 담궈도 된다.
Methanol의 추가여부는 methanol의 type에 따라 달라질 수 있다. 우리가 쓰는 transfer buffer의 구성을 보면 glycine과 Tris-HCl로 구성되고 여기에 20% Me-OH가 첨가된다. 단백질이 70kDa 이하면 methanol의 농도가 20%정도면 되지만, 70kDa이 넘어서 100kDa정도까지는 methanol농도를 10%, 100kda이 넘어가면 methanol은 첨가해주지 않아도 된다. 이것은 단백질의 크기가 크면 methanol이 방해를 하기 때문에 methanol이 없어도 된다. 반면에 크기가 작으면 methanol의 방해가 일어나도 methanol이 단백질과 membrane의 친화력을 크게 증가시키므로 metanol을 일정농도 첨가해주어야 한다.
네모난 단위로 쌓아놓고 덮어서 transfer해준다. 수행한 후 membrane을 꺼내서 skim milk에 담궈서 blocking하고 4 C에 보관하면 영구적으로 보관할 수 있다. skim milk에서 blocking을 하는데 coting을 해주어야 한다. blocking은 매워주는 역할로 band 나머지부분이 매워진다. 특이적인 band가 있는 위치에 antibody가 붙게 된다. Primary antibody는 -GST를 이용하여 단백질을 잡아주는 역할을 하고 secondary antibody는 -mouse IgG인 HRPO로 IgG를 잡아주는 antibody를 사용한다. H2O2를 기질로 하여 발색반응 일으키는데 film 위에 검은색으로 태워 탄 부분 안 탄 부분 구별을 하게 할 수 있다.
이렇게 4주간에 걸친 실험을 마감하게 되었다. 그러면 여기서 protein 발현여부를 확인하기 위한 western blotting을 수행할 때 왜 SDS-PAGE를 사용하는 것일까? 기본원리는 cell extracts로부터 특정 protein을 detection하기 위해서 먼저 gel electrophoresis를 이용하여 size 별로 분리해 낸다. 이 과정에서 protein을 순수하게 size별로 분리해내기 위해서, protein을 단위 질량당 charge와 단백질의 3차원 folding 구조를 모두 같게 해줘야 한다. 그런 이유로 protein을 SDS-PAGE를 수행하는 것이다. SDS를 detergent로 사용해서 protein을 모두 단위질량당 같은 정도의 negative charge를 띠게 해줘서 각 protein의 전하 차이를 제거하고 동시에 folding구조를 깨뜨려서 shape 차이로 인한 이동속도의 변화를 없게 해준다. 따라서 이러한 처리를 가해준 protein은 순수하게 size에 해당하는 정도로 (-)electrode로부터 (+) electrode를 향하여 transfer 시킨다. 이 과정에서도 역시 protein의 전하 특성을 이용하여 (-) electrode 쪽에는 gel을 (+) electrode 쪽에는 membrane을 놓게 된다. 이렇게 하면 size별로 분리된 protein이 그대로 membrane으로 이동하게 된다. 그 후에 membrane 상에서 우리가 관심을 갖는 대상 protein에 대한 primary antibody와 secondary antibody를 이용하여 western blotting을 수행할 수 있는 것이다. 발색반응을 이용해 x-ray film을 태우고 암실에서 현상하여 Marker band와의 거리를 계산하여 원하는 단백질이 발현 또는 순수 정제 되었는지 확인한다. 만약 western blotting에서 결과가 나오지 않았다면 그 이유를 여러 가지로 생각해볼 수 있다. 우선 antibody를 넣어줄 때 antibody의 희석이 잘 못되어서 western blot 자체가 이상하게 나올 수 있다. 또 membrane으로 protein이 transfer된 후에 blocking을 하게 되는데 이것은 membrane의 protein-untransfered 부분을 다른 균일한 protein으로 막아버리는 것으로서 더 이상 다른 protein으로부터 membrane이 오염되는 것을 방지하는 것이다. band가 거의 보이지 않는 것은 blocking이 잘 안되었다고 예상할 수 있다. 그러므로 skim milk의 반응시간과 농 우리는 이 실험을 통해서 단백질을 순수 분리해서 발현을 확인하는 단계까지 모두 수행해 보았다. 결코 짧지 않은 실험을 통해서 실험의 여러 가지 스킬을 익히게 되었고 protein의 발현 여부를 확인해볼 수 있었다.
Ⅵ. Reference
- 분자생물학 노트, 유전공학연구소, 곽주원외 2인, 158~162pp
- Biochemistry, freedom, Jeremi외 2인, 65, 103p
- 분자생물학, 아카데미서적, 김병흥 저, 315~317pp
- http://yasuar.hihome.com/lifescience/protein001.htm
- http://blog.naver.com/caserin_kim?Redirect=Log&logNo=140020140416
- http://www.fhcrc.org/science/labs/hahn/methods/biochem_meth/coli_total_protein.htm
- http://www.komabiotech.co.kr/product/molecular/Electro/gel_02.htm
- http://www.gcomin.co.kr/data/163/F162203.html

키워드

western blotting,   SDS-PAGE,   단백질분리,   유전자재조합