Transformation of competent E. coli(예비 및 결과)

목차

실험목표
실험원리 및 이론
-Transformation 이란?
-Transfomation된 개체의 판별
-Competent cell
-Competent cell 을 이용한 Transformation 의 과정
-Vector
-Plasmid Vector
-transformation의 방법
실험방법
실험결과(CELL사진첨부)
고찰 및 토의
참고문헌

본문내용

얇게 펴는 작업을 한다. 이때 cell을 배지에 잘 심기위해서, 불로 소독을 한후, 뻑뻑한 느낌이 느껴질때 까지 계속 펴주는 작업을 한다. 그다음 37℃ incubator에 12hr culture를 시키는 시험이었다. 여기에서 Competent cell은 정상적인 박테리아에 화학적 처리를 하여 DNA가 잘 들어갈 수 있게 만든 cell을 의미한다.
이번 실험결과는 사진으로 볼 수 있듯이 좋은 결과를 얻을 수 있었다.
이번 실험에서 우리가 만든 competent cell 이 transformation을 통해 ampicillin에 내성을 갖게 되었고, LBA(LB+Ampicillin) plate에서 E.coli가 생장했다는 것으로 확인할 수 있었다.
일반적으로 transformation은 비교적 낮은 빈도로 발생한다. 그것은 transformation이 일어나기 위해서 bacterial cell wall이 얇아져야 하기도 하고, 또, 그 transformant로 작용하는 DNA fragment가 cell의 exonuclease 작용을 피해 살아 남아야 하기 때문이기도 하다. 따라서 우리가 비록 미리prepare된 competent cell을 그 재료로 사용했지만, 비교적 낮은 transfomation 효율을 얻은 것은 설명이 가능하다.
그러나, 이론적으로, 개체들이 배지내에 고른 농도로 분포되어 있다고 한다면, 서로 proportional하게 spread된 배지의 양에 따라 transformaiton된 개체의 수도 proportional하게 나타나야 한다. 같은 competent cell을 사용했고, 같은 양의 vector를 넣어 주었으며, 같은 시간 배양했음에도 배양한 개체수에서 차이가 나는 이유를 생각해 보면 다음과 같은 오차가 발생했을 수도 있다.
- 외부 DNA vector를 가할 때 조작상의 잘못으로 인하여, 알코올램프에서 너무 가깝게 접근한 나머지, DNA vector가 일부 파괴되었을 수도 있다.
그런데 만약 이와같은 경우라면 아마도 하나의 colony도 남아 있지 않았어야 할 것이다. 왜냐하면, 우리가 이 과정에 사용한 기구는 micropippet이고 이 기구는 대단히 미세한 양을 운반하는 것이기 때문에, 만약 이 안의 시료에서 cell이 파괴되었다고 한다면, 거의 모든 cell이 파괴되었을 것이기 때문이다.
- 두 번째로 spreading할 때 spread하는 기구를 살균한 뒤 덜 식힌 채로 spread 조작을 해버려서 transformation된 개체가 파괴되어 버렸을 가능성이다.
그러나, transformation 자체의 효율이 확률적으로 떨어졌을 가능성도 아주 배제할 수는 없다. 우리가 최대한 동일한 상황을 상정하려고 노력하였지만, 그것이 완전히 동일하다고는 볼 수 없기 때문이다.
※ 암피실린에 저항성이 있는 플라스미드를 가지고 있는 박테리아를 LB 배지에 배양하면은 콜로니가 형성되는데 이때 이 배지를 장시간 배양하면 콜로니 주위에 플라스미드가 없는 2차 콜로니가 형성된다. 이 2차 콜로니가 생기는 이유는?
- 이것을 보통 satellite colony 라고 하는데, 암피실린 이용한 배지에만 나타나는 현상인데 암피실린에 저항성이 있는 유전자의 산물인 베타락타메이즈(beta lactamase) 가 콜로니가 자라면서 주변의 암피실린을 깨어버리기 때문에 그 부근에서는 플라스미드(암피실린저항유전자가 포함있는)를 가지고 있지 않은 E.coli가 자랄 수 있게되는 것이다.
고체배지에서 키운 E.coli의 콜로니를 옮길 때 이러한 satellite colony를 옮기지 않도록 주의해야 하고, 장시간 키우지 않는다면 2차 콜로니는 생기지 않을 것이다.
※ Ampicilin resistance gene
암피실린은 antibiotics로 이러한 유전자가 없으면 E.coli는 죽게되고, 플라스미드에 이러한 유전자가 있으면 플라스미드를 가지고 있는 E.coli 는 죽지않게 된다.
따라서 이러한 유전자는 플라스미드를 포함한 E,coli만을 선택하고자 할 때 이용된다. 이러한 예는 Transformation과정에서 유용한데 이러한 유전자의 성질을 이용하여 플라스미드를 E.coli에 넣어줄 때 암피실린이 들어간 배지에서 키우게 되면 플라스미드가 들어간 E.coli와 그렇지 않은 E.coli를 쉽게 분리할 수 있게 됩니다.
※ ampicillin 의 영향
암피실린이 안들어가거나 적게 들어가는 경우는 콜로니 크기가 커지는 것이 아니라 콜로니 수 가 많아질 것이다.

키워드

E. coli,   Transformation,   이코일,   플라스미드,   Competent