식물에서 RNA 추출

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식물에서 RNA 추출에 대한 보고서 자료입니다.

본문내용

반면 mRNA는 세포 내 전체 RNA중 1∼5% 정도를 차지하고 있으며 크기(수백개에서 수천개 염기)와 염기배열 순서가 다양하다. 그러나 거의 모든 포유동물의 mRNA에는 3'쪽 끝에 poly(A) tail이 있어 oligo(dT) cellulose를 이용한 affinity chromatography로 순수분리 할 수 있다. 세포로부터 RNA를 원형대로 분리하기 위해서는 RNase의 작용을 최소화하는 것이 가장 중요하다. RNase는 여러 형태의 물리적 작용에 저항성이 있지만 4 M guanidine isothiocyanate와 환원제인 β-mercaptoethanol 용액 내에서는 불활성화된다. 또한 대부분의 단백질 역시 guanidine chloride나 guanidinium isothiocyanate와 같은 강력한 변성제 용액에 쉽게 녹는다. 단백질의 정렬된 2차 구조가 소실됨에 따라 세포구조가 붕괴되고 RNA나 DNA에 결합된 단백질 역시 핵산으로부터 분리된다. 따라서 이들 시약을 이용하여 RNA를 분리하면 RNase가 풍부한 췌장조직에서도 완전한 형태의 RNA를 분리할 수 있다.
* RNA 분리에 필요한 모든 시약은 DEPC를 처리한 증류수를 이용하여 제조하여야 한다.
(2) CTAB (Cetyltrimethylammonium bromide: C9H42N+Br-)
SDS와 같이 이용되는 양이온 계면활성제.
핵산(nucleic acids)하고 결합해서 nucleic acid-CTAB complex를 만듦. 원심분리를 하게 되면 nucleic acid-CTAB complex가 침전.
(3)DEPC (diethyl pyrocarbonate)
histidine을 선택적으로 alkylation시키는 물질. 대부분의 RNase들의 active site에는 Histidine이 있고 따라서 DEPC는 효과적으로 RNAse를 inactivation시킬 수 있다. 이에 RNA 관련된 실험에 쓰이는 물이나 buffer등에 DEPC가 많이 쓰인다.(단 아민기가 많은 Tris Buffer등에는 사용할 수 없는 점에 주의)DEPC는 발암물질로 추정되므로 다루는 과정에서 항상 조심하도록 한다. 증류수를 DEPC로 처리할 경우에는 DEPC를 0.1%(w/v)로 증류수에 첨가한 후 하룻밤 동안 stirring bar를 이용하여 계속 섞으면서 열을 가한다. 다음날 아침 증류수에서 DEPC 냄새가 나지 않으면 자가멸균하여 사용한다. DEPC가 용액 내에 남아 있으면 안 된다. 또한 대부분의 용액은 용액을 모두 만들어 DEPC를 처리해도 되지만, Tris 등의 용액은 용액 속에 직접 DEPC를 넣으면 안되고 DEPC 처리한 증류수로 만들어야 한다.
*RNA을 다루는 모든 solution은 반드시 DEPC 처리가 요구됨.
1L의 물에 1ml의 DEPC을 첨가한 후, string 하고 37℃에서 12시간 정치하거나, 30분간 autoclave하여 사용함.단, DEPC는 primary amines과 반응할 있으며, Tris buffer 내에서는 불안정하므로 Tris buffer을 만들 때 직접 사용할수 없으며 DEPC을 먼저 처리하여 완전히 녹인 후, tris을 첨가하여 pH을 맞추어야 한다.
DEPC-treated water: DEPC는 NH2, SH, OH group들을 modify하여 RNase를 비롯한 여러 protein의 enzyme activity를 불활성화시킨다. DEPC처리는 매우 효과적인 방법으로, RNA와 접촉할 solution을 처리하는 데에 유용하다. Ambion의 DEPC-treated water는 packing 전에 한 번, 후에 한 번 모두 autoclave를 하여, 확실한 멸균 처리 및 DEPC의 완전한 inactivation을 보장한다.
참고) RNase
RNA(리보핵산)의 분자내 인산디에스테르결합을 절단하는 효소. (DNA 가수분해효소: DNase) 정식명칭은 ＜리보뉴클레아제(ribonuclease)＞이다. 동·식물에서 세균·곰팡이에 이르기까지 널리 분포한다. 대표

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RNA,   추출,   식물