유전학 실험보고서

목차

1. colony selection
2. plasmid isolation
3.전기영동(Electrophoresis)에 의한 DNA분리
4. 제한효소 (restriction enzyme)
5. E.coli : transformaion
6. 접합(Conjugation)
7. Transduction 형질도입-> bacteriophage
8. PCR(Polymerase Chain Reaction)
9. RNA isolation / DEPC solution / 주의점
10. Protein expression / SDS-Page / IPTG induction

본문내용

3) Corepressors
만일 아미노산 tryptophan(Trp)이 배지 중에 첨가되면, 세균은 트립토판을 합성할 필요가 없다. 세균에서 트립토판의 생합성에 필요한 효소들도 하나의 operon으로 존재한다. Trp repressor에는 operator binding region과 Trp binding region이 있는데, Trp repressor에 Trp가 결합하면 Trp operon의 operator에 결합하게 된다. Trp의 양이 줄면 repressor에서 Trp가 떨어져 나오게 되며, 더 이상 operator에 결합하지 못하게 되고, Trp 합성에 필요한 효소들이 전사되게 된다.
4) 양성 조절 단백질
Trp operon이나 lac operon은 필요 없는 단백질의 합성을 막아주는 일종의 억제적 전사조절 방법이다. CAP단백질은 두 가지의 결합부위를 가지고 있다. CAP는 세균이 포도당을 사용하는지 유당을 사용하는지 결정해 준다.
5) CAP　DNA　binding protein
CAP는 두개의 같은 단백질의 복합체이다. CAP의 C터미널 쪽에 구부러져 연결된 두개의 알파 helix가 존재하며, 이중 하나는 DNA의 특정 염기 배열과 결합한다. CAP와 DNA의 결합방식은 다양한 DNA 결합단백질에서도 나타난다.
->DEPC solution
DEPC는 rxlase 저해제 단백질의 화학 수식제로 사용되는 시약이다.
->주의점과 유의사항
RNA는 핵산분해 효소에 의해 분해되기 쉬우므로 뉴클라아제는 땀이나 손가락을 비롯해 여러 가지 혼합되는 일이 있기 때문에 주의
시약끼리 또는 용액끼리의 contamination을 방지하기 위해 가능한 일회용의 피펫이나 시약관류를 사용하고 1회만 사용하는 것이 바람직하다. (조금이라도 혼입의 위험이 있을 때 교환할 것)
DEPC 는 발암성이 있으므로 취급에 주의한다.
10. Protein expression / SDS-Page / IPTG induction
->protein expression
translation(원핵세포의 번역) 전사된 mRNA는 세포질에서 번역되어 단백질로 전환된다. 원핵세포의 경우는 핵과 세포질의 구별이 없어서 전자와 동시에 번역될 수 있다.
1)시작단계 : Ribosome의 작은 소단위체가 mRNA의 5‘side에 결합해 완전한 ribosome의 p site 개시 tRNA가 결합하면서 번역을 시작한다.
2)연장단계 : 이전 아미노산과 새로 들어온 아미노산 사이에 펩타이드 결합이 형성한다. 아미노산 사슬의 길이가 점점 길어지게 된다.
3)termination : ribosome은 mRNA를 따라 점점 3‘쪽으로 내려가다 보면 UAA ->SDS -PAGE : 강력한 음전하를 띈 세제인 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 처리하면 단백질의 소수성 부위에 결합하여 비 공유 결합을 제거하고 균일한 음전하를 띈 2차 구조를 잃은 단백질이 일직선으로 펼쳐지게 된다. 다시 단백질의 공유결합에 관여하는 S-S결합을 mercaptoethanol과 같은 환원제를 사용하여 제거하면 완전히 풀린 1차구조가 된다. 전기장이 형성되면 단백질은 결합하고 있는 수많은 SDS 전하에 의해 양극으로 이동한다. 크기가 큰 분자는 천천히 이동하므로 작은 분자부터 분리된다. 전기영동에서 크기가 같은 단백질은 gel에서 같은 위치에 이동하게 된다. 이렇게 분리된 단백질은 ccomassie blue와 같은 염료로 염색하여 관찰할 수 있다.
->IPTG induction
발현 백터가 가져야 할 중요한 특징중에 하나로 원하는 시간에 원하는 장소를 발현하도록 만들어져야 한다. 이를 induction이라고 하는데 IPTG가 그 역할을 한다.
lac operon을 보면이 보통 발현백터에는 T7 promoter 다음에 lac operater가 위치한다. 이 부분에 lac repressor가 결합하고 있어 평상시에는 T7 RNA polymerase의 작용을 막고 있다. 이러한 operater 자리에 결합하고 있는 lac repressor는 allolactose와 같은 inducer와 결합하면서 떨어지게 되고 이로서 전사가 시작된다. IPTG는 allolactose와 비슷한 구조를 가지며 동일한 기능을 가진 인공화합물로 가수분해 되지 않는 특징 때문에 allolactose 대신 이용되고 있다.

키워드

PCR,   유전학,   제한효소,   박테리오파지,   콜로니,   plasmid,   전기영동,   유전학실험