유전자 CG10047

소개글

유전자 CG10047에 대한 보고서 자료입니다.

목차

◎ 지정 유전자 : cg10047

1. 주어진 유전자의 gene structure & organization을 작성하되, extended gene sequence 위에 promoter including -35 consensus sequence & -10 TATA box, 5\'UTR, exon, intron, coding region including start & stop codon, 3\'UTR, poly A recognition sequence, transcription termination site 등을 표시하시오. 또한 각 intron에서 splicing donor, acceptor, branch point의 conserved DNA sequence를 찾아보시오

2. 이 유전자의 coding region, 즉 start codon부터 stop codon까지의 sequence를 사용하여 restriction enzyme map을 작성하시오. Program을 이용하되, 주요 enzyme site는 유전자를 하나의 선으로 그리고 그 위에 표시하시오.

3. 이 유전자의 coding region (CD)을 pBlueScript plasmid에 cloning 하기 위한 구체적인 실험 design을 하시오. 단 CD는 PCR 방법으로 증폭하기로 하고 primer design으로부터 시작하시오. Double restriction enzyme digestion을 하되, 이 방법이 사용 불가능할 경우는 single digestion 방법을 사용하시오. enzyme 선택의 이유도 제시하시오.

4. Transformation 후, screening 과정을 거처 bacterial colony로부터 plasmid를 추출했을 때, 이 recombinant DNA가 제대로 된 insert를 가지고 있는지를 확인하기 위한 enzyme mapping 방법을 구체적으로 제시하시오. 즉, 어떤 enzyme을 어떤 조건에서 사용할 것이며, 예상되는 fragment size는 얼마인지 등을 제시하시오.

5. Protein sequence로부터 hydropathy plot을 작성하고 이 protein의 topology를 예측해보시오.

6. 같은 coding region을 pET30 expression vector에 cloning 한 뒤, His-tag을 이용하여 bacterial cell로부터 protein을 추출하고자 할 때, 구체적인 cloning site를 정하고 design 하시오.

7. 만약에 cloning은 정상적으로 되었는데 단백질 추출이 되지 않았을 경우, bacterial cell 내에서 무슨 일이 일어났을지 가설 설정과 원인을 밝혀낼 수 있는 방법 및 이 문제를 해결하기 위한 대안을 제시해 보시오.

본문내용

mo-4-chloro-3-indolyl-D-galactopyranoside)은 lactose 대신 beta-galactosidase에 의하여 대사되는 물질이다. 일종의 변형된 galactose sugar로서 원래 무색이지만 beta-galactosidase에 의하여 대사되면 푸른색을 내게 된다. 즉, Ampicllin 처리에 colony를 형성한 것 중에서 X-Gal/IPTG 처리로 흰색을 보이는 colony가 원하는 gene이 plamid에 재조합되어 들어가 있는 cell이다.
4. Transformation 후, screening 과정을 거처 bacterial colony로부터 plasmid를 추출했을 때, 이 recombinant DNA가 제대로 된 insert를 가지고 있는지를 확인하기 위한 enzyme mapping 방법을 구체적으로 제시하시오. 즉, 어떤 enzyme을 어떤 조건에서 사용할 것이며, 예상되는 fragment size는 얼마인지 등을 제시하시오.
ampicillin과 X-Gal/IPTG의 선별법으로 Plasmid가 없는 경우 또는, Plasmid 내에 insert DNA가 없는 경우를 선별해 낼 수 있다. 하지만 선별된 박테리아가 가지고 있는 것이 재가 원하는 insert DNA임을 확인할 필요가 있다. 그 이유는 우선 PCR product가 순수한 것이 아니고, 또한 어디선가 오염이 되었을 가능성이 있기 때문이다.
첫 번째 방법으로...
① 확인해야하는 Bacteria에서 순수한 Plasmid만을 정제해난다(Alkali lysis method).
② 정제한 Plasmid에 원하는 insert가 있는지 확인하기 위해 insert의 가장자리에 위치한 제한효소를 처리한다.
③ 이것을 Gel 전기영동을 하여 insert와 Vector의 크기를 확인한다. 하지만 이것이 전기영동에서 우리가 원하는 insert DNA와 크기가 같다고 하여 똑같은 것이라 확정할 수는 없다.
④ DNA sequencing 과정을 이용하여 insert의 DNA sequence인지를 확인한다.
두 번째 방법으로...
① 확인해야하는 Bacteria에서 순수한 Plasmid만을 정제해난다(Alkali lysis method).
② insert DNA 내에 존재하는 제한효소 사이트와 plasmid에 존재하는 제한효소 사이트를 찾아서 그 제한효소를 처리한다. SmaⅠ을 처리한다.
③ 이것을 Gel 전기영동을 하여 크기를 확인한다. 크기는 약 0.5kb이다.(532뉴클레오티드)
5. Protein sequence로부터 hydropathy plot을 작성하고 이 protein의 topology를 예측해보시오.
6. 같은 coding region을 pET30 expression vector에 cloning 한 뒤, His-tag을 이용하여 bacterial cell로부터 protein을 추출하고자 할 때, 구체적인 cloning site를 정하고 design 하시오.
+ 2번 문제 참고
7. 만약에 cloning은 정상적으로 되었는데 단백질 추출이 되지 않았을 경우, bacterial cell 내에서 무슨 일이 일어났을지 가설 설정과 원인을 밝혀낼 수 있는 방법 및 이 문제를 해결하기 위한 대안을 제시해 보시오.
Start Codon ~ Stop Codon :
ATGCATATGTTGCCTAACATACCTGTTGT
CCTTTCAGTTGTCCCCGCCATCCTGGGACTGACTGCGGCTGCTGTCCTCT
CGTCAGTGGCCTGCATCTGCGCCCGGCAGATGCGCCTCCGGAACAAGAAA
CAGAGCCAGCACGACGCCTCGTTCCCCTTCCAGCCGACCCGGCGACCGAC
CGCCGTTCGATCGCCCAGCGGCCAGCCGCCGCACTACTTGAAGAAGTCGC
CCTCGCCGACGGGAGGCAAGCAGATGGGACTGCTGTCGCCGATGCAGGAC
CAGTCCACCTCCCCGATTGCGCAACCGAATGTCAAGTACAGCGAGGAGGG
AGATGGACCCGCCCAGCATGCGGAGCAGCAGAATGGCAATCAACTGACCG
TGGTGGATGGTAATGGGTTGAAGCACTCGCTGCACAACAGCCTTCACCAC
TCGCCGGTAGAGACGATCGCCAACGGAAGTGTGACCATTACCCTGGACGA
CCATTCGCTGACCAACGGGAAGGAGCTGACCGTGACCGACCAGTACGGCA
AGCTGGGTACCATCTATTTTAAGCTGCGCTACTTGGCCGAAAGGAACGCC
CTTATGGTGTCCATCATCCGTTGTCGCGGACTCCCCTGCAAGGGAGGATC
GAGCGGAACCGGAGATATTCCCACTGGCATGAATGGACGCACTCAGGCGG
CAACGGATCCGTATGTCAAGCTGCAGCTGCTGCCGGACAAGCAGCACAAG
GTCAAGACCCGGGTGGTGCGAAATACCCGGAACCCGGTTTACGACGAGGA
CTTCACCTTCTACGGCCTGAACATGAACGACCTGCAGAACATGTCGCTGC
ACTTTGTCATCCTCAGCTTCGATCGATACTCACGTGACGACGTCATTGGC
GAAGTGGTGTGCCCATTGACCTCCATCGAGATCGGGGACATCTCCAAAGA
GGCTTTGTCCATCAGCAAAGAGATCCAGCCACGGAGCTTGAAGATTCGAG
CCCAGGGTCGCGGGGAGCTGCTCATCTCCCTCTGCTGGCAACCAGCTGCC
GGTCGCCTCACCGTCGTCTTGCTGAAGGCCCGAAACTTACCGCGCATGGA
TGTCACCGGACTGGCCGATCCGTATGTTAAGATATATCTCCTCTACAATG
GCCAACGCATCGCCAAGAAGAAGACGCACGTGAAGAAACGAACTCTGAGC
CCCGTTTTCAACGAGAGCTTCGCATTCGATATTCCCGCCGCCGAAGTGAG
TAATAGTATATTCATTTACTATTTGTTTGTAGTTTAA
kb = 이중가닥 DNA의 경우, 10의 3승 뉴클레오티드 쌍 또는 단일가닥 DNA의 경우 10의 3 뉴클레오티드
5kb=5000뉴클레오티드

키워드

CG10047,   유전자,   gene structure,   organization,   conserved DNA sequence,   restriction enzyme map,   coding region,   start codon