β-Galactosidase purification & activity & SDS PAGE

소개글

β-Galactosidase purification & activity & SDS PAGE에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Introduction

2. Materials

3. Method

4. Result

5. Discussion

6. References

본문내용

섯 번째에 넣은 물질은 1.5% ammonium persulfate로 이것은 자유반응기를 생성하여 acrylamide와 bisacrylamide의 polymer를 형성 시켜 점성이 생기기 때문에 나중에 넣어주는 것이 좋다. 마지막으로 TEMED를 넣어주었다. TEMED(N, N, N\',N\'-tetramethylethyl-
enediamine)는 ammonium persulfate로부터 생기는 자유 반응기(free radical)의 생성을 촉매하여 acrylamide와 bisacrylamide의 polymer 형성을 촉진시켜 gel이 굳게되므로, ammonium persulfate와 함께 마지막에 넣어주어야 한다. TEMED는 자유염일 때에만 작용하므로 낮은 pH에서는 polymer 형성이 방해를 받는다. TEMED는 발암물질을 함유하고 있기 때문에 다룰 때에 조심해야 했다.
이렇게 하여 만들어진 resolving gel을 유리판 사이에 부 어 주었다. stacking gel도 부어주어야 함을 감안하여 판 의 2/3정도까지 resolving gel을 부어 주었다. 판에 gel을 부은 후에는 gel이 너무 딱딱하게 굳지 않도록 수분을 보 존하기위해 n-butanol을 넣어주었다.
gel이 다 굳을 때까지 30분간 방치해 두었다.
30분후 resolving gel이 다 굳은 후에 판에 증류수를 조금 부어 n-butanol을 헹구어 냈다. filter paper를 이용하여 판속의 물기를 제거하였다. 이때 paper가 gel에 닿지 않도록(gel이 손상될 수가 있으므로) 주의해야 했다. 물기를 완전히 제거한 다음 1-B조가 만든(만드는 방법은 resolving gel을 만드는 방식과 같다.) stacking gel을 판에 부어주었다. 단백질을 loading할 입구를 만들기 위해 comb를 꽂아야 하므로 약1cm정도를 남겨둔 만큼 stacking
gel을 부어 주었다.
comb
stacking gel
resolving gel
gel을 부을 때에는 기포가 생기지 않도록 주의해야 했다. gel을 다 부은 후에는 comb을 꽂아 준 다음 gel이 굳도록 방치하였다. stacking gel이 굳는 동안에 시료를 준비하였다.
7개의 test tube에 각각 marker와 β-galactosidase, 두 번째 β-galactosidase의 활성을 알아보는 실험에서 activity가 높았던 sample(#1,#2,#13,#14,#15) 5개를 준비하였다. 각 sample과 β-galactosidase를 10μl씩 넣고, bromophenol
blue를 각각 10μl씩 넣어주었다. maker로는 bromophenol blue를 사용하였는데, 이렇게 marker를 사용하는 이유는 gel 이 투명하기 때문에 marker로 염색함으로써 size별 구분이 용 이하게 하도록 함이었다. 이렇게 준비한 7개의 시료는 100℃ 에서 3분간 가열하여 단백질을 변성시켰다.
gel이 다 굳은 후에 comb을 제거하고, 굳힌 gel을 전기영동 기구에 장치하고 위와 아래 완충용액 통에 전기영동 완충용액을 부었다.
[전기영동 완충용액]
전기영동 완충용액(25 mM Tris, 250mM glycine (pH 8.3), 0.1% SDS)의 글리신은 아 미노산의 성질로 인해 음전하를 띠거나 net charge가 0인 zwitter이온 형태로 존재한다. gel에 형성된 well(시료를 넣기 위해 뚫린 구명)에 단백질 시료를 가하고 전기영동을 시 작하면 Cl-이온과 단백질, 글리신-이온이 모두 +극을 향해 출발하게 된다(Zwitter이온은 움직이지 않는다). 그런데 글리신은 stacking gel의 낮은 pH에서 다시 평형을 이루어 일 부가 zwitter이온이 되어버리기 때문에 이 부분에서 움직이는 이온(mobile ion)이 없어 지고, 결과적으로 전류가 감소하게 된다. 그러나 전체 겔 시스템의 전류는 유지되어야 하므로 이를 극복하기 위해 Cl-이온과 글리신-이온 사이에 매우 높은 전압차가 형성된 다. 이때 상대적인 이동속도는 글리신- < 단백질 < bromophenol blue < Cl-이 된다. (Cl-는 작기 때문에 빠르고, 단백질은 glycine보다 크지만 음전하가 많아서 빠르다). 모 든 단백질은 acrylamide 농도가 낮은 겔에서 움직임의 제한을 받지 않고 높은 전압차에 의해 빠르게 이동하지만, Cl-이온 앞쪽이나 글리신-이온 뒤쪽으로는 높은 전압이 없으므 로 이 사이(얇은 disc)에 모두 모여 이동되는 셈이다. 이들이 resolving gel에 도달하면 이곳에서 글리신은 높은 pH로 인해 거의 모두 음전하가 되어 위와 같은 효과는 사라지 고, 또한 acrylamide의 농도가 높기 때문에 단백질은 크기에 따라서 분리가 시작되게 된 다.
완충용액을 부은 후, gel홈에 시료를 가했다. 시료를 홈에 정확히 loading하기가 어려웠다. 「loading이 끝난 후 전기 영동 기구를 전원에 연결시킨 후 전압을 걸어주었다. 전기 영동이 끝난 후 gel의 3배에 해당하는 염색액(coomassie-
brilliant blue)에 담근 후 염색이 충분히 될 때까지 서서 히 흔들어주었다. 염색이 다 되면 염색액을 제거한 후 염 색약이 포함된지 않은 destaining solution에 gel을 담가두어 탈색 시켰다.」(「」부분실험엔는 참여하지 못했습니다.ㅠ,ㅠ )
다음날 전기영동의 결과를 확인하였다. 그렇데 결과가 그다지 좋지 못하였다.
조교님이 나누어주신 Protein Maker 표본을 보면 70kDa(빨간선)을 기준으로 각각의 크기를 나타내는 위치에 위로는 3개의 bend가, 아래로는 6개의 bend가 나타나야 하는데, 우리 실험에서는 70kDa 이하로는 6개의 bend가 나타났으나, 70kDa 이상의 bend는 모두 출발선상에 중첩되어 있었다. 그래서 70kDa 이상의 size를 구별할 수가 없었고, 각각의 sample들을 볼 때에도 bend가 연하게 나타나서 정확한 bend 위치를 파악하기가 어려웠다. 또한 marker를 포함한 모든 sample이 start 위치에서 뭉쳐있음을 볼 수 있었다. 이는 시간에

키워드

β-Galactosidase,   전기영동,   크로마토그래피,   SDS