액체크로마토그래피-HPLC에의한카페인분석-2

본문내용

아데닌과 카페인의 RT는 <실험 1>의 결과 값과 거의 일치할 것이다. 이것은 나중에 여러 가지 물질이 섞여있는 혼합시료의 액체 크로마토그래피를 구할 때 무엇이 카페인인지를 구별할 수 있는 근거가 된다.
* <실험 2>의 결과에 대해
<실험 2>에서는 아데닌과 카페인의 흡수 스펙트럼을 작성하였다. Lambert-Beer 법칙의 A=εbC 에서 흡광 계수인 ε은 파장에 따라 변하게 되는데, 이것이 최고가 되는 파장을 찾아서 <실험 3>에 이용해야 했다. 왜냐하면 흡광도를 이용하여 어떤 미량의 화합물을 검출하고 정량적으로 분석하기 위해서는 빛을 최대로 흡수하는 파장을 선택하여 감도를 최대로 하는 것이 좋기 때문이다. 이렇게 하여 얻어진, 각 물질의 최대 흡수 파장은 아데닌이 260㎚, 카페인이 270㎚였다. 그래프를 관찰하면 중간 중간에 아데닌과 카페인의 peak이외에 작은 굴곡들을 볼 수 있다. 이는 실험 도중에 파장을 변화시키면서 생긴 것이다. 파장을 변화시키면 용액을 주입하지 않은 상태라도 eluant인 물과 메탄올의 흡광도가 변하게 되어, 그래프에 일시적으로 굴곡이 생기게 되지만, 해당 파장에서의 물과 메탄올의 흡광도로 다시 0점 조절을 하면 원래 높이로 돌아오게 된다. 270㎚에서 280㎚로 넘어가는 부분을 보면 그래프가 그 부분에 한해 전체적으로 들어가 있는데, 이는 0점을 맞추는 과정에서 문제가 있던 것으로 보인다. 그러나 실험의 요점은 흡광한 양을 나타내는 곡선 아래의 면적이므로 큰 문제는 없을 것으로 생각된다.
* <실험 3>의 결과에 대해
<실험 3>에서는 커피 한 잔 내의 카페인 양을 구하기 위해서 100M와 200M의 카페인 용액을 이용하여 standard curve를 작성하고, 커피용액을 용리시켜 카페인의 흡광도를 측정함으로써 그 농도와 질량을 구해냈다. standard curve를 이용하여 물질의 흡광도로 그 농도를 구한 원리는 Lambert-Beer의 법칙에 근거한 것이다. 이 법칙에 따르면 물질의 흡광도는 그 농도에 비례하므로 농도를 정확히 알고 있는 용액의 흡광도를 측정함으로써 그 비례상수를 알 수 있다. 따라서 100M와 200M의 카페인을 이용하여 standard curve를 작성하였다. 그 다음에는 커피 용액을 HPLC기기에 주입하여 <실험 2>로부터 알아낸 270㎚의 파장 하에서 용리시켰다.
결과에 나타난 peak를 관찰했을 때 대략 8가지 이상의 물질로 구성되어 있을거라 추측할 수 있다. 이상 이라고 한 까닭은 극미량이라 기기에 의해 검출되지 않았거나 실험을 끝낸 시점보다 RT가 더 큰 물질이 있거나, 270㎚의 빛은 거의 흡수하지 않는 물질이 포함되었을 수도 있기 때문이다.
<실험 1>에서 구했던 RT와 가장 비슷한 값을 갖는 8번째 peak의 물질을 카페인이라 추정할 수 있었으며 이를 이용해 카페인의 농도 및 커피 한 잔 내의 카페인의 양을 계산할 수 있었다.
조사에 따르면 동결건조 인스턴트커피 한 잔 내에는 대략 65㎎~100㎎의 카페인이 들어있다고 한다. 실험에 쓰인 커피용액의 부피는 일반적으로 마시는 커피 한 잔의 양보다 조금 적은 편이며, 그 농도 또한 희석시킨 것이었으므로, 적절한 실험 결과를 얻었다고 할 수 있겠다.
* 핸드아웃에 있는 추가질문
1) 사용한 컬럼의 사이즈, packing 물질 및 크기 등 내역 (specification)
2) Adenine과 Caffeine의 Retention Time, 재현성
→ Adenine과 Caffeine의 RT는 각각 1.9917과 3.3567로 극성이 더 큰 Adenine의 경우 Caffeine보다 이동상과의 인력이 커, RT가 짧았다. 또한 RT는 한 조건에서 물질의 극성과 같은 고유한 특성에 의해 결정되는 값으로 같은 조건에서 실험했을 때 동일하게 나오므로 재현성을 갖는다.
3) Eluant의 메탄올 함량을 늘렸을 때, Retention Time은 어떻게 변할까?
→ Eluant의 메탄올 퍼센트를 늘린다면, 원래 물의 극성이 메탄올보다 크기 때문에 결과적으로 이동상의 극성이 낮아지게 될 것이다. 극성의 순서가 카페인<아데닌<메탄올 인데, 이동상과 시료의 극성차가 줄게 되므로 두 사료 모두 다 Retention Time이 짧아질 것이다.
4) Adenine과 Caffeine의 흡수 스펙트럼 및 최대 흡수 파장
→ 각 물질의 흡수 스펙트럼은 Data&Results 의 <실험 2>의 결과에 제시되어 있으며, 최대 흡수 파장은 Adenine은 260㎚ 근처, Caffeine은 270㎚ 근처라고 추측할 수 있다.
5) 흡광도 값의 비로부터 미지시료 용액의 농도를 구하는데 사용되는 법칙
→ Lambert-Beer의 법칙을 사용하였다. (A=εbC) 이 식에 의하면 용액의 흡광도는 농도에 비례하므로, 농도를 아는 용액과 그 흡광도로부터 상수에 해당하는 εb를 알아냈을 때, 미지시료의 흡광도로부터 그 용액의 농도를 구할 수 있다.
6) Freeze-dried coffee에 들어있는 Caffeine의 무게 퍼센트
→ 100㎖ 커피 용액에 원래 700㎎의 커피분말을 넣었으므로, (계산 편의를 위해 이때의 부피변화는 무시한다.)
×100 = 2.94(%)
7) 시간이 충분히 주어질 경우, 보다 정확한 정량을 위해 할 추가 실험
<실험 2>에서 실험하는 파장의 범위를 좀 더 세분화해서 정확한 최대 흡수 파장을 알아본다.
<실험 3>에서 좀 더 다양한 농도의 카페인 용액을 이용해 더 정확한 추세 선을 얻는다.
<실험 3>의 커피용액을 이용한 실험에서 질량이나 부피 측정에 오차가 있을 수 있으므로 여러 번 실시해본다.
REFERENCE
표준 일반 화학실험 제 5개정판, 대한 화학회
크로마토그래피; 액체크로마토그래피의 원리와 응용, 이대운, 1991, 민음사, p.59~60,355~357
최신분석화학, Paniel C.Harris, 자유아카데미, p.331,334~336,362~363
Principle of Modern Chemistry, Oxtoby, 6ed, p.608
네이버 백과사전 (검색어: Beer's law, Lambert's law, Lambert-Beer's law, HPLC)

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액체,   크로마토그래피,   카페인,   분석,   HPLC