전자 현미경 보고서

목차

< 전체적인 과정 > TEM용과 SEM용을 구별하여 준비

✡✡ 조직 접수
✡ 투과전자현미경 (TEM : transmission electron microscopy)
- 목적 : 조직의 단면의 변화를 보기 위한 현미경

1. 고정
2. 탈수
3. 치환
4. 침투 및 포매
5. 중합
6. 박절
7. 일반 전자염색 (routine electron stain)
8. 관찰 및 사진촬영
9. 필름 현상
10. 사진 인화

✡ 주사전자현미경 (SEM; scanning electron microscopy)

1. 시료 채취
2. 고정
3. 탈수
4. 치환
5. 임계점 건조
6. 증착 (coating)
7. 관찰
8. 현상 및 인화

✡ 말초신경 분리검사 (nerve teasing)
✡ 면역전자현미경 (Immuno Electron Microscopy)

H1N1 바이러스
1. 면역 반응 단계에 따른 분류
2. 표지 물질에 따른 분류

본문내용

(stub)에 접착시킨다.
6. 증착 (coating)
- 시료의 표면에 금속을 입히는 과정
- 생물 시료 표면의 전기적, 열적 전도성 확보 (비전도성 시료의 도체화)와 풍부한 2차 전자선을 방사시키는 표면을 만드는 작업 (2차 전자 발생 효율 향상)
- 시료의 심부로 1차 전자가 들어가는 것을 막고 시료내부에서 발생하는 2차 전자를
차단하여 정확한 표면구조의 형성을 돕는다.
- 전자선의 열에 의한 손상으로부터 보호
- 증착 장치; Ion sputter
* 사용금속 : 금, 백금 등
* 시료대에 건조된 조직을 넣고 내부를 진공상태로 한 후 전류를 보내면
금속입자가 방출되어 조직의 표면에 coating된다.
* 약 100 ~ 200Å 정도의 두께
7. 관찰
- 진공 중에 놓여진 시료의 표면에 전자빔이 주사되면 시료로부터 2차 전자, 반사전자,
X-선 음극광이 발생되며 시료가 얇을 경우는 투과전자가 생긴다.
- 이들 발생 신호는 각각의 적당한 검출기에 의해 전기 신호로 변화되어 영상화된다.
- 적당한 구도와 배율에서 사진촬영을 한다.
8. 현상 및 인화
- 투과형 전자현미경의 방법과 동일
말초신경 분리검사 (nerve teasing)
- 순서
① 2.5% glutaraldehyde로 냉장에서 2시간 이상 overnight 고정한다.
② 0.1 M phosphate buffer sol. 으로 10분씩 2회 수세한다.
③ 1% Osmium tetroxide(OsO4)로 1시간 고정한다.
④ 40% glycerin에서 1시간 반응시킨다.
⑤ 70% glycerin에서 1시간 반응시킨다.
⑥ 90% glycerin에서 1시간 반응시킨다.
⑦ 100% glycerin에서 1시간씩 2번 반응시킨다.
⑧ 입체현미경을 보며 예리한 forcep을 이용하여 신경조직의 막을 제거하면서 신경을 가닥가닥 분리하여 슬라이드에 가지런히 놓는다.
⑨ Glycerin으로 봉입한 뒤 labelling 하여 판독실에 입고한다.
면역전자현미경 (Immuno Electron Microscopy)
- 목적 : 전자현미경 단위에서 항원의 존재를 확인하기 위한 방법
- 원리 : 투과형 전자현미경 조작과정 중에 항원 항체반응을 실시한 후 이차항체의
표지자로 전자현미경 하에서 관찰이 가능한 물질을 이용하여 관찰하는 방법
면역반응을 이용하여 전자현미경으로 항원의 분포를 검출하는 방법. 투과현미경 관찰용으로는 면역반응을 포매하기 전인 전포매(前包埋)와 후에 시행하는 후(後)포매가 있다. 전포매법에서는 고정한 시료의 동결절박절편을 1차항체, 2차항체와 차례로 반응시킨 후에 관찰한다. 후포매법에서는 친수성 수지에 시료를 포매시키는 경우가 많다. 2차항체에는 금입자나 페리틴 등의 전자밀도가 큰 금속이라든가 과산화효소 등의 효소로서 표지한 것들을 사용한다. 후자의 경우는 반응생성물을 4산화오스뮴으로 염색시켜 검출을 용이하게 한다. 직경이 다른 금입자로 표지한2종류의 2차항체를 사용한 2중염색도 가능하다. 또 2차항체 금속입자의 반사전자선과 시료의 2차전자선을 주사형 전자현미경을 이용하여 포개 맞추어 시료 표면의 항원분포를 분석한다.
1. 면역 반응 단계에 따른 분류
- 포매 전 방법 (Pre-embedding method) : 면역염색을 실시 후 포매, 중합하여 박절, 관찰
* 10 ~ 50 ㎛정도 두께의 조직 절편에 면역 염색
* 항체의 침투가 약하나 면역 반응후 전자현미경 조작 과정을 거치게 되므로 Osmium에 의한 항원 소실을 줄일 수 있다.
- 포매 후 방법 (Post-embedding method) : 포매, 중합, 박절 후 면역 염색하여 관찰
* 항원의 소실을 막기 위해 수용성 포매제를 이용
* 포매제 : LR white, Lowicryl K4M 등
* block의 강도가 현저히 떨어짐으로 인해 박절에 장애가 됨
* 미세구조의 관찰이 어렵다.
- 동결 초박절편법 (Frozen ultrathin section method) : 초저온으로 조직을 동결하여
박절 후 면역 염색하는 방법
* 화학 고정제의 영향을 받지 않아서 항원의 보존에 우수
* 단 시간내에 관찰 가능
* 조직의 얼음결정 생성 방지 및 양호한 절편을 얻기 위한 고도의 숙련도 요구
2. 표지 물질에 따른 분류
- Ferritin 표지 항체
* 23%가 철이며 전자현미경으로 관찰이 가능
1) Singer & Schick법(1961) : toluene 2,4-diisocynate가 pH7.5에서는 한쪽만이
단백질과 결합반응을 하고, 이어서 pH 9.5로 항체와
반응시키는 방법을 고안해 냈다. 이 방법은 2종의
단백간에 각 단백끼리의 결합을 피하여 특이적으로
결합하는 것이 특징이다.
2) Ram 법 (1963) : p,p'-difluro-m, m'dinitrodiphenyl sulfone을 이용하여 효율이
좋은 ferritin과 항체를 결합시키는 방법이다. 이 ferritin표지
항체는 세포막 표면의 항원 국재 증명에 공헌하였다.
단점 : ferritin표지 항체가 너무 커서 세포나 조직내에는 침투하지 않기 때문에
수지 포매된 조직의 초박절편상으로 항원의 국재를 시도하였으나, ferrtin표지
항체는 수지와 강한 친화성이 있어 이 표지의 이용은 한때 이용되지 못하였다.
그러나 Tokuyasu(1973)에 의해 동결 초박절편의 제작법이 개발되면서
ferritin표지 항체의 이용도가 증가하였다.
- 효소 표지 항체
* 일반적인 면역 염색 후 DAB (diaminobenzidine)를 처리하면 Peroxidase에 의해 산화하여 갈색의 침전물이 항원부위에 침착. 이 침전물에 Osmium을 처리하면 Osmium-black을 형성하여 전자밀도가 상승
1) 직접법 : 항원에 대응하는 항체에 직접표지물질 즉, 효소를 표지하는 방법이다.
2) 간접법 : 제 1항체에는 표지하지 않고 제 1항체에 대한 제 2항체를 표지하는 방법으로
ABC법, PAP법, 효소표지 protein A 법 등이 있다.
- Colloidal gold 표지 항체
* 입자의 크기를 다르게 염색함으로써 두 가지 이상의 항원 존재여부를 동일한 절편에서 시행 가능

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