[생화학 실험보고서] Sub 클로닝, 원형플라스미드 DNA 지도제작

본문내용

52 X
6. 고찰
1) 원래는 plasmid와 DNA가 제대로 ligaion이 되었는지 확인하기 위해 restriction mapping을 사용하지만 지난주에 ligation한 plasmid와 DNA를 사용하지 않아서 조교님께서 주신 plasmid + DNA ligate의 restriction enzyme site를 결정하기 위해 mapping을 실시하였다.
2) 실험 결과를 보면 Nde I + Xho I의 band가 하나 밖에 나오지 않았다. 소량의 restriction enzyme이나 restriction buffer를 다룸에 있어 미숙하였기 때문인 것 같다. 발광 정도를 더 늘려서 확인하였을 때에야 더 size가 작아 밑에 위치하는 band를 확인할 수 있었는데, 이는 size가 큰 조각이 더 많이 있어서 일 수 도 있지만 DNA의 small fragment의 경우 오랜 시간동안 전압을 loading했을 때 detection이 잘 되지 않기 때문이다. 때문에 Nde I + Xho I enzyme cutting한 실험 결과는 ①, ② 모두 4조의 실험결과를 이용하여 계산하였다.
3) Restriction mapping을 보면 실험이 어딘가 잘못 되었다고 금방 판단할 수 있다. Restriction enzyme의 경우 Type Ⅰ, Ⅱ, Ⅲ로 나눌 수 있는데, Type Ⅰ은 bipartite, asymmetrical site를 인식하며, type Ⅱ는 4 ~ 6 squence, Type Ⅲ는 5 ~ 7 bp를 인식한다. 하지만 내가 mapping한 바에 의하면 Nde Ⅰ과 BamH Ⅰ의 사이가 2.59 bp밖에 차이가 나지 않았다. 더구나 대부분의 plasmid가 200 kb정도임을 감안하면 전체 크기라고 할 수 있는 제한효소 Nde I나 Xho I로 자른 실험군이 의미하는 1.44 X bp와는 맞지 않는다. 또한, 전체적인 plasmid의 bp는 차치하고 실험결과만을 보면 Size A, B, C의 총합이 전체 plasmid의 크기와 대체로 비슷해야 하는데 약 3배 이상의 오차를 보이므로 실험이 잘못 수행되었다는 것을 알 수 있다.
4) 오차의 원인을 분석하여 보자면 Standard curve의 추세선의 식의 기울기가 너무 작게 나왔다는 데 있다. Standard curve의 추세선이 잘못 나온 이유는 실제 marker의 각 위치를 자로 쟀을 때 1 mm 이하는 버림으로 계산하였기 때문일 것이다. cm는 조금씩 변하더라도 bp의 경우 log scale로 증가하기 때문에 실제 약간의 오차가 결과적으로 큰 변화를 야기할 수 있기 때문이다. 추세선에 의문을 갖아 standard curve의 값을 실제 식에 대입하여 본 결과
Marker (bp)
Log bp
Well과의 거리 (cm)
추세선 식 대입결과(cm)
10000
4
2
4.4319
8000
3.90309
2.2
4.460759798
6000
3.77815
2.4
4.49796693
5000
3.69897
2.6
4.521546734
4000
3.60206
2.9
4.550406532
3000
3.47712
3.1
4.587613664
2500
3.39794
3.3
4.611193468
2000
3.30103
3.7
4.640053266
1500
3.17609
3.8
4.677260398
1000
3.00000
4.3
4.7297
700
2.84510
4.8
4.77582922
500
2.69900
5.3
4.8193378
300
2.47712
5.6
4.885413664
로 나타났다. bp값이 증가할수록 well과의 거리가 감소하는 추세는 보이고 있으나 실제 y값과는 거리가 먼 결과이다. R2 = 0.9717 > 0.9이므로 추세선은 비교적 정확하다고 말할 수 있으나 standard의 추세선 식 대입 결과가 모두 4 cm 안팎으로 분포하고 있으므로 보다 정확한 standard를 구하기 위해서는 computer program을 이용하여 최대한 정확한 유효숫자를 갖도록 하여 계산하여야 할 것 같다.
5) 실험 결과가 정확하다고는 말할 수 없지만 Nde I과 BamH I으로 잘랐을 때의 크기인 size A과 BamH I, Xho I으로 잘랐을 때의 크기인 size B, Nde I과 Xho I으로 잘랐을 때의 크기인 Size C를 비교하여 보면 BamH I과 Nde I의 restriction site가 Xho I에 비해 비교적 가깝게 분포되어 있음을 알 수 있다. 실제 어떤 plasmid가 실험에 사용되었는지는 알 수 없지만 그 plamid의 restriction site는 위 실험 결과에 포함된 size difference를 보인다고 할 수 있다. 아래는 plasmid중 하나인 pRS424의 restriction site를 보여주고 있다.
6) Competence란 cell이 존재하는 환경에서 extracellular (naked) DNA를 외부로부터 받아들일 수 있는 능력을 말한다. Competence는 크게 유전적으로 박테리아가 갖는 natural competence와 실험실에서 일시적으로 DNA를 손쉽게 받아들일 수 있도록 만든 induced or artificial competence로 나눌 수 있다. DH5α란 competent cellf로 만들어진 E. coli의 한 strain을 뜻한다.
7) Transformation을 할 때 DH5α를 vortexing하여 급속으로 녹였는데, 이는 plasmid가 competent cell로 transformation되는 확률을 낮출 것으로 예상된다. 외부의 열과 충격에 약한 상태인 competent cell이 망가질 우려가 있기 때문에 시간이 좀 더 걸리더라도 얼음에서 충분한 시간을 갖고 녹이는 것이 좋은 방법일 것 같다.
7. 참고문헌
1) 생화학실험(2) 실험교본, 교육과학기술부의생명특성화사업단.
2) Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert Stryer. 2007, Biochemistry, sixth ed. pp 87 ~ 169
3) www.wikipedia.org에서 competent cell 조사 및 plasmid 그림

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