경희대학교 분자생물학 실험보고서 DNA subcloning - Competent cell (Com.cell), 암피실린

소개글

경희대학교 분자생물학 실험보고서 DNA subcloning - Competent cell (Com.cell), 암피실린 에 대한 보고서 자료입니다.

목차

introduction
1. Competent cell (Com.cell)
2. Ampicillin & β-lactamase
3. lac operon
4.α-complementation

material, procedure

result & discussion

reference

본문내용

ll에 넣어서 그 결과를 알아보는 실험으로, Ligation이 잘 되었는지를 확인하기 위해 Amp배지에 넣고 Colony의 생성 유무를 확인하는 실험이었다.
우리조의 실험결과, 우선 다른조에 비해 Colony의 양이 상대적으로 많았고, colony의 색이 전부 같은 색으로 나왔는데 그 이유는 지난 실험의 실패를 교훈삼아 protocol을 정확하게 지켰고, 동선을 최소화 해서 불필요한 동작을 줄임으로써 Com.cell의 사멸 및 plate에 다른요소가 유입될 확률을 최소화 하려고 했기 때문으로 생각한다.
먼저 DNA Tube에 Com.cell을 넣을 때 tapping으로 섞는 이유는, Com.cell membrane 이 Cacl2및 RhCl로 인해서 postive charge를 띄게 되면서 약해졌기 때문으로, 작은 충격에도 세포가 사멸할수 있다. Com.cell에 DNA를 넣기위해 Heatshock 기법을 사용하였는데, Physical way(전기충격을 주어 DNA를 삽입하는 방식) 에 비해 별다른 장비가 필요없는 장점이 있지만, 효율은 Physical way 보다는 효율이 많이 떨어지는데, 효율이 떨어지는 대신, aga plate에 발현되는 Colony의 수가 적다보니 쉽게 구분될수 있는 이점이 있다. Heat shock 과정 중 Com.cell LB를 넣고 1시간 정도 기다리는 이유는 Com.cell에 DNA가 삽입되는것을 기다리는 이유도 있지만, 삽입된 이후 Com.cell이 β-lactamase를 생성해서 Amp 배지에서 생존 가능하도록 하는데 목적이 있다. 또한 LB를 넣을 때 알코올 램프를 켜둔 상태에서 작업을 하는 이유는, 작업도중, Com.cell의 공기중 확산을 통해 인간에게 감염되는 것을 막기 위함으로, 알코올 램프 주변의 기류가 변화 하기 때문에, Com.cell이 실험자에게 올라오지 못하게 된다.
실험에서 사용한 Xgal은 β-galactosidase의 enzyme reaction 결과 파란 색을 나타내게 되는데, 만약, Aga plate에 다른 germ이나 이물질이 들어가서, 배양될 경우 다른 색깔의 Colony를 관찰할 수 있는데, 다행히 이번실험에서 발견된 Colony는 전부 같은 파란색을 띄는 것으로 보아, 본 실험결과에서 별다른 이물질이 나타나지 않았음을 알 수 있다. 이번실험에서는 관찰되지 않았지만, Blue colony가 아닌, White colony가 발생할수 있는데, 이것은, MCS(multiple cloning site)가 Vector내의 PLASMID 뿐만 아니라, 염색체 내에 역시 존재하기 때문으로, ligated DNA가 Vector의 염색체로도 삽입이 되어, α-peptide가 생성되지 않아 결국 β-galactosidase 를 만드는 α-complementation이 이루어지지 않았기 때문이다.
Microtube에는 Com.cell이 200μL가 있었지만 그 중 100μL만 배지에 뿌린 이유는, 그 이상의 com.cell을 넣으면 Amp의 반응할수 있는 양을 초과하기 때문에, Amp로 삽입이 된 Vector를 제대로 가릴수 없을뿐더러, 뜻하지 않은 세균이 들어올 경우 Amp가 세균을 죽일수 없기 때문에, Filtering을 제대로 할수 없게 된다.
배양을 하기 전 Aga plate를 거꾸로 뒤집어서 배양 시키는데, 그 이유는 첫째로, plate 뚜껑에 물이 맺혀 떨어질 경우 colony들이 섞일 우려가 있고, 또한, plate를 뒤집어 놓음으로써 plate 내로 공기가 들어가지 않게 하기 위함이다.
최종적으로, plate 가장자리에 이름을 써서 나중에 colony를 관찰하는데 방해가 되지 않도록 하였다.
Reference
1) Biochemistry & Molecular biology at Michigan State Universitity
-Learning Module - Experiment 5A
Transformation of E. coli XL-1 Blue and DM700 with pTrc99A/topAcysB DNA
http://www.bch.msu.edu/bchug/web/bch472/LM5A.html
2) New England Biolab - NEB-5α
http://www.neb.com/nebecomm/products/productC2988.asp
3) 네이버 지식사전 - amphicillin, lac operon
http://terms.naver.com/entry.nhn?docId=293243

키워드

com.cell,   heat shock,   형질전환,   transformation,   암피실린