단백질분리및정제기술에대하여

소개글

단백질분리및정제기술에대하여에 대한 보고서 자료입니다.

목차

단백질 기술이란?

단백질 분리 및 정제 기술

■ 단백질의 분쇄 및 원심분리
■ 염석 (Salting Out)
■ 투석 (dialysis)
■ 크로마토그래피 (Chromatography)
■ 전기영동 (Electrophoresis)

배양세포로부터 단백질의 분리

본문내용

EMED 20㎕를 넣어준다.
⑦ 전기영동 장치에 위 혼합액을 붓고 Comb을 유리벽을 따라 끼운다.
3. Sample 준비
① crude solution (4㎕)
② ammonium sulfate dialysis (4㎕)
③ ammonium sulfate 상등액 (10㎕)
④ washing solution (20㎕)
⑤ elution solution (10㎕)
☞ 위 각각의 sample에 loading dye를 첨가시킨다.
①+3㎕ : 7㎕
②+3㎕ : 7㎕
③+4㎕ : 14㎕
④+5㎕ : 25㎕
⑤+4㎕ ; 14㎕
☞ 끓는 물에 boiling시킨다.(3분)
4. Pipetting
☞ 전기영동 장치에 Tris glycine SDS buffer을 넣고 Pipetting 한다.
① crude solution (7㎕)
② ammonium sulfate dialysis (7㎕)
③ ammonium sulfate 상등액 (14㎕)
④ washing solution (25㎕)
⑤ elution solution (14㎕)
⑥ size marker (12㎕)
⑦ high weight size marker (5㎕)
5. 전기영동 장치에 전하를 걸어준다.
6. gel을 탈색시켜 관찰한다.
단백질을 분리하는 방법은 분리하고자 하는 단백질이 무엇인가에 따라서 매우 다양하다. 단백질이 핵에 존재하는 지 세포질에 존재하는지에 따라서, 또 단백질의 성질에 따라서 적당한 방법을 선택하여 써야한다. 가장 처음에는 조직이나 세포로부터 핵단백질이나 세포질단백질 또는 전체단백질을 분리하는 것으로 시작하며, 이로부터 수많은 정제과정을 거쳐야 원하는 단백질을 분리할 수 있다. 이 과정은 대단히 노력, 끈기, 자본을 요하는 것으로써 평생동안 한가지 단백질을 정제하는 과학자도 있음을 생각해야 한다. 여기에서는 정제되지 않은 전체 단백질(whole cellular protein)과 핵단백질(nuclear extract)을 분리하는 방법만을 소개하기로 한다. 물론 여기에도 수많은 방법이 있을 수 있다.
A. 배양세포로부터 단백질의 분리
1) 전체 세포단백질(whole cellular extract)의 분리
실험방법
1. 단층으로 자란 배양세포를 1 ml의 PBS로 두번 세척한다.
2. 배양접시에 붙은 상태로 얼음에 올려놓고 300 ml의 용해용액(RIPA 용액: 150 mM NaCl, 1% NP-40, 0.5% DOC[deoxycholic acid], 0.1% SDS, 50 mM Tris-Cl, pH 7.5)을 가한다.
3. 30분간 가끔씩 흔들면서 얼음에 둔다.
4. 1 ml pipette을 사용하여 수차례에 걸쳐 lysate를 올렸다, 내렸다를 반복하여 뻑뻑하지 않을 때까지 시행하면 genomic DNA가 모두 shearing 되었다고 볼 수 있다.
5. 이 용액을 미세원침관으로 옮기고 4℃,15,000 rpm에서 10분간 원심분리한다.
6. 상층액(세포단백질)을 새 미세원침관으로 옮긴다. 이 용액은 SDS-PAGE에 이용할 수 있다.
2) 핵단백질(nuclear extract)의 분리
핵단백질의 분리는 1단계의 핵분리과정과 2단계의 단백질 분리과정으로 나눌 수 있으며, 핵을 분리하는 방법에 따라서 여러가지 방법이 있다. 순수한 핵단백질을 원하는 경우 핵분리를 순수하게 해야 하지만 시간과 노력이 많이 들기 때문에 여러가지 세포에서 동시에 분리하기에는 어려움이 많다. 여기에 소개하는 방법은 Schreiber(1989)이 소개한 간단한 방법이다.
실험재료
용액 A: 10 mM HEPES, pH 7.9, 10 mM KCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 mM EGTA로 구성되고, 사용 직전에 DTT(dithio threitol)을 1 mM로, PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)를 0.5 mM로, 그리고 여러가지 protease inhibitor cocktail을 목적에 따라 만들어서 첨가하여 사용한다.
10% NP-40
용액 C: 20 mM HEPES, pH 7.9, 0.4 M NaCl, 1 mM EDTA, 1 mM EGTA로 구성되고, 사용 직전에 DTT를 1 mM로, PMSF를 1 mM로, 그리고 protease inhibitor cocktail을 첨가하여 사용한다.
1. 단층배양세포를 1 ml의 PBS로 두번 세척하고 0.5 ml의 PBS를 첨가한 다음 policeman으로 긁어 미세원침관으로 옮긴다.
2. 4℃ 원심분리기에서 15,000 rpm으로 1~2분간 원심분리한다.
3. 상층액을 제거하고 PCV(packed cell volumn)을 가늠해본다. 세포에 따라 다르지만, 10 cm 배양접시에 confluent 상태로 자란 세포(약 107)에서 시작한 경우 약 150 ml 정도 될것이다.
4. 용액 A를 400 ml 넣고 부드럽게 pipette으로 풀고 약하게 vortex한 후, 얼음에 15분간 둔다. 이 과정에서 세포가 용해되기 시작한다. 핵막은 보존되는 상태이다.
5. 10% NP-40을 25 ml 넣고 10초간 세게 vortex한 후 4℃에서 15,000 rpm으로 1~2분간 원심분리한다. 상온에서 최고속도로 30초 원심분리하기도 한다.
세포의 종류에 따라서 NP-40의 농도를 변화시키는 것이 좋은데, 이를 넣지 않는 실험자도 많이 있다.
6. 상층액을 버리고 침전된 핵의 부피(packed nuclear volumn, PNV)를 가늠해본다. 이를 50 ml의 용액 C에 풀고, 4℃에 설치된 shaker에서 비교적 강하게(level 6~7) 흔들면서 15분간 둔다.
7. 4℃ 원심분리기에서 최고속도로 5분간 원심분리한다. 상층액이 핵단백질이다. 약간의 하얀 물질이 딸려올 수 있는데, SDS-PAGE 및 western blot 용으로는 큰 문제가 없다. 0.5~1.0x106 세포에서 출발한 경우 1~2 mg/ml 농도로 총 55~100 mg의 단백질을 얻을 수 있다.
-참고자료
한국 기능유전체 연구소
재조합 단백질의 생산 및 분리 정제 기술: 유전공학 연구소 이상기
친화성 고분자 유도체 합성 및 단백질 분리 정제에 관한 연구

키워드

단백질분리 및 정제,   정제기술,   단백질분리