식물 형질전환 개요

소개글

식물 형질전환 개요에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1.Introduction
2.실험방법 개요
- method
- result
- discussion
3.배지의 성분과 제조
4.식물체내로의 유전자 도입 방법
5.항생제의 종류와 작용기전
6.WESTERN-BLOT
7.Reference

본문내용

)
(주의: NC는 반짝이는 면이 Gel과 닿아야 한다)
3) NC위에 filter를 1장 덮고, 스폰지 2장을 마찬가지로 transfer buffer에 적셔 덮는다.
* Gel을 한 장만 쓸 때
+ Blotting pad
Blotting pad
Filter paper
Transfer membrane
Gel
Filter paper
Blotting pad
- Blotting pad
(단, Gel 한 장만 쓸 때는 Blotting pad를 더 채워 꽉 차게 할 것)
* Gel을 2장 쓸 때 + Blotting pad
Blotting pad
Filter paper
Transfer membrane
2nd Gel
Filter paper
Blotting pad
Filter paper
Transfer membrane
1st Gel
Filter paper
Blotting pad
- Blotting pad
4) 카세트를 떨어지지 않도록 클립으로 조인다.
5) 카세트 내의 membrane이 충분히 잠기도록 transfer 완충용액을 넣는다
6) 카세트 주위에 얼음을 채운다. (Pitfall: 홈에 얼음이 안들어가게 해야 한다)
7) 전압은 최소, 전류를 최대로 한 뒤, on.
25V로 맞춘다.
8) 1시간 반 동안 transfer한다. 그동안 딴 일을 한다.
5. Immunoblot
1) transfer된 것을 blotting pad 제거 후, forcep으로 filter paper, NC, gel, filter paper를 한꺼번에 뒤
집어서 꺼낸 다음, filter paper를 제거하고, NC와 gel 만 거름종이 위에 올려놓는다.
2) 볼펜으로 gel의 4개의 모서리를 기준으로 NC위에 점을 찍는다.(marking)
3) marker가 있던 자리에도 점을 찍는다.
4) gel의 맨 위에 찍어진 세 개의 점을 자를 대고 볼펜으로 줄을 긋는다.
(Pitfall: 이 때 자는 NC위에 올려놓으면 절대 안되고, 잘려져 나갈 NC위에 대고 긋는다)
5) Gel을 벗겨 버린다.
6) NC를 칼을 가지고 자를 대고 4개의 모서리 점과 윗 변의 선을 따라 자른다.
7) marker Ag넣은 부분만 잘라내어, Ponceau S에 15분간 담가 놓았다가 꺼내, 물로 씻어
band가 잘 나왔나 확인한다.
(Ponceau S는 한 번 쓰고 버리지 말 것)
8) 샤알레 위에 NC를 놓고, 1% BSA-TBST을 적정량 부어, 항온기안 Dance위에 30분간 놓아둬 block시킨다.
* 1% BSA (bovine serum albumin)
BSA 0.5g / TBST 50ml
(Pitfall: 거품이 일지 않게)
* TBST
TBS(x10), ml
100
DW, ml
900
Tween20, ml
0.5
(pitfall: Tween 20은 굉장히 끈끈해서, pipetting 이 잘 안되므로, tip을 잘라서 끼울 것)
* TBS(x10): pH 7.5
1M Tris
121.1g/Liter
1.5M Nacl
87.66g/Liter
9) TBST용액으로 항온기에서 10분간 washing
10) NC 를 거름종이사이에 끼워 말린다.
11) NC를 고르게 잘리는 기계에 밑 부분부터 넣어 반쯤 자른 후, 밑 부분에 번호를 매긴다.
12) 잘린 slice들을 홈에 secondary antibody 갯수에 따라 차례로 넣는다.
13) 각각의 홈에 TBST 800 ul를 넣고, 녹인 serum 200ul 또는, primary antibody(Ab)를 홈에 넣은 후
항온기에서 30분간 Dance위에 올려 놓는다.
(각각 첫 번째 홈에는 제일 잘 나오는 한 사람의 positive control의 serum을 넣어
interNC variation을 최소화한다)
(pitfall: serum을 eppendorf tube에서 피펫팅 할 때는 bubble이 안나게 살살 피펫을 돌려가면서 뽑
는다)
14) 10cc Pipette으로 TBST의 적당량을 각각 홈에 넣어 3분간, 5번 washing 한다.
(pitfall: NC strip이 홈의 벽에 붙지 않게 하고, TBST를 넣을 때, 넘쳐서 옆의 홈에 절대 들어가지 않게 한다)
15) 3번쯤 washing하고 있을 때, 다음 단계를 미리 준비한다.
즉, secondary antibody(Ab)를 dilution한다.
예) Ig G, Ig A, Ig M, total Ig이면, 4개의 tube를 준비하여,
Ig G, total Ig 는 1: 1000으로 (예: 3ul/ TBST 3ml)
Ig A, Ig M는 1: 500으로 하였다.
16) washing이 끝난 strip을 secondary Ab의 숫자에 맞춰서 새로운 홈통에 재배치한다.
예) 환자 A가 strip 번호가 1번부터 4번이라면, 홈통 4개를 준비하여 1번홈통(예: Ig G) 첫 번째 홈에
1번을 넣고 해서, 4번째 홈통 (예: total Ig)의 첫번째 홈에 4번 strip을 넣는다.
(pitfall: Ig G를 딴 피펫은 total Ig을 딸 때 그냥 써도 되지만, Ig A나 Ig M을 딸 때는 tip을 꼭 바꿔 준다.)
17) 각각에 TBST로 dilution된 secondary Ab 를 넣고, 30분간 항온기 안에서 dance위에 올려놓는다.
18) 30분후 따라버리고, TBST로 3분간 5번 washing한다. (항온기 내 dance위에서)
19) 3번째 washing을 할 때쯤, 발색제를 만든다.
* 발색제 : AP buffer + BCIP sol + NBT sol. (모두 냉장보관)
* AP buffer
100mM Tris
100mM Nacl
5mM MgSO2
pH를 9.5로 맞춘다.
* NBT sol: NBT 100mg/ 70% DMF(dimethylformamide) 2ml
* BCIP sol: BCIP 100mg/ 100% 을 2ml
20) washing 한 것을 비우고 발색제를 넣어 30분간 항온기에 둔다.
21) 30분쯤 지나면, band가 예쁘게 나타나면 성공!
22) 수돗물로 슬슬 홈통을 씻은 뒤 꺼내, 거름종이 위에 올려 놓고 말린 후 한 줄로 가지런히 모아 놓
는다.

키워드

[자연과학] 식물 형질전환,   항생제의 종류,   배지의 성분과 제조