양배추로부터 PLD추출 (예비보고서)

소개글

양배추로부터 PLD추출 (예비보고서)에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1.실험제목
2.실험목적
3.실험원리
4.효소의분리 및 정제
5.시약 및 기구
6.실험방법

본문내용

탁액을 가만히 두면 밀도가 높은 물질은 중력의 영향으로 서서히 바닥으로 가라앉고 밀도가 낮은 물질은 서서히 상층부로 이동하게 되는데 이런 과정을 침전이라 한다. 밀도차가 나는 물질이 섞이면 침전현상이 발생하게 되고 시간이 지나면 혼합물을 밀도 차에 따라 분리해 낼 수 있다. 혼합물끼리 밀도 차는 혼합물을 분리해주는 힘인 중력이 강해질수록 커지므로 인위적으로 중력을 크게 해 주면 침천 현상을 가속 할 수 있다. 중력대신 원심력을 이용하면 쉽게 침전현상을 가속시킬 수 있는데 이런 과정을 원심분리라 한다. 원심분리기의 속도는 1분 동안의 회전수인 RPM(revolutions per minute)이나 중력 가속도인 g값으로 표시한다.
사용법
주의사항
일반적으로 고속 원심분리기를 사용할 경우엔 원심분리 하고자 하는 물질이 한 개라 하더라도 반대편에 그 물질의 무게와 같은 것을 넣어주어 무게평형을 맞추어 원심분리 해야 한다. 용량이 더욱 커질수록 이 부분에 대해 주의를 기울여야 하는데 이는 원심분리 시 회전을 할 때 무게가 한 쪽으로 쏠리는 현상을 방지하기 위해서이다. 만약 평형이 맞지 않으면 기계 모터에 손상이 가게 된다.
실험 방법
Mixer에 양배추(1/6정도의 양)를 잘게 잘라서 넣고, 250 mL 증류수를 첨가한다.
→ PLD가 수용성이라 증류수 사용한다.
→ 양배추가 딱딱하여 잘 갈리지 않기 때문에 증류수 소량을 같이 넣는다.
500 mL 비이커 입구에 거즈를 덮고 움푹 들어가게 하여 고무줄로 입구를 묶고 용액을 안전하게 붓는다.
→ 거즈를 짜면 원하지 않는 다른 단백질 분해효소도 같이 나오므로 짜지말고 그대로 둔 상태에서 안 녹는 성분을 분리하기 위해 거른다.
500 mL 비이커 아래 용액을 50 mL conical tube에 약 35 mL 정도로 채우고 약 3개의 sample을 만들어 3,500 rpm에서 15 min 정도 원심분리를 한다.
→ conical tube에 용액을 채울 때, 부피보다는 서로의 높이나 무게가 같도록 채운다.
→ 원심분리 후, 확실하게 분리가 되었는지 확인 후에 다음 단계로 넘어간다. 그렇지 않으면 다시 원심분리를 한다.
Cold centrifuge 후 상층액(2개의 sample 양)만 취해 50 ℃에서 5 min 동안 물중탕을 한다.
→ 물중탕을 통해, PLD 이외에 섞여있는 효소들은 구조의 변성을 일으켜, 수용성의 성질을 잃게 되어 침전시킬 수 있다. PLD는 S-S 결합을 통해, 5분간 50℃ 상태에서는 변성을 일으키지 않는다.
얼음물에서 20 min 동안 냉각시킨다.
→ 용해도를 떨어뜨려, PLD 이외의 변성된 효소들을 침전시키는 과정이다.
다시 3,500 rpm에서 20 min 동안 cold centrifuge 한다.
→ 원심분리 후, 확실하게 분리가 되었는지 확인 후에 다음 단계로 넘어간다.
1 L 비이커에“6번”상층 액만 모아서 그 양의 2배 부피만큼 cold acetone을 첨가 한다.
→ 아세톤 양의 조절이 중요
→ 아세톤의 첨가 및 온도 감소에 의한 용해도 감소로 PLD가 침전으로 석출되기 시작한다.
옅은 미색의 침전이 생기면 역시 6,000 rpm에서 6 min 동안 cold centrifuge를 한다.
상층액을 버리고 PLD가 있는 하층 액만 모아 냉동고 또는 동결건조 시켜서 보관한다.
→ 하층액은 gel 상태
→ 약 -80℃ 온도에서 보관.
→ 상층 액을 버릴 때 하층 액이 같이 내려가지 않도록 조심한다.
→ 아세톤이 남아있으면, PLD의 활성이 없어질 수 있고, 시간을 오래 두고 보관하여도 활성이 없어 질 수 있기 때문에, 아세톤은 최대한 제거시키고, 실험 후 최대한 빠른 시간 내에 다음 실험을 진행한다.

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