[A+] Gel Extraction예비레포트

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목차

1. 실험제목
2. 실험날짜
3. 실험목적
4. 실험이론
5. 시약 및 기구
6. 실험방법
7. 참고사항
8. 참고문헌

본문내용

넣는다.
1분간 14,000 rpm 으로 원심분리한다.
하층액은 버려준 뒤, binding column tube에서 나오는 용액이 없을 때까지 반복하여 원심분리를 한다. (8000 rpm, 1 min)
하층액은 버려준 뒤, 500 μl 의 Washing buffer 1 (WB1)를 rim이 젖지 않게 첨가하고 원심분리한다. (14,000 rpm, 1 min)
하층액은 버려준 뒤, 500 μl 의 Washing buffer 2 (W2)를 rim이 젖지 않게 첨가하고 원심분리한다. (14,000 rpm, 1 min)
⑨번 과정을 1회 반복한다.
하층액을 제거하고 1분간 14,000 rpm 으로 원심분리한다.(drying) 하층액이 나오지 않을 때까지 반복한다.
Binding column을 새로운 1.5 ml micro-centrifuge tube로 옮기고, 미리 예열시켜 놓은 30 ㎕ 의 Elution buffer (EA)를 가한 뒤 5 min 동안 상온에 방치한다. 이후 14000 rpm으로 1분간 원심분리한다.
Nano drop을 사용하여 DNA의 농도를 측정 후 Gel Extraction된 DNA를 20℃에서 보관한다.
참고사항
7.1) 참고사항
Gel Binding buffer(GB)
: Kit의 resin(Binding Column)에 DNA가 잘 붙을 수 있게 한다.
Washing Buffer(WB)
: 에탄올이 들어가, DNA 이외의 RNA, 단백질, 각종 당류, 불순물을 세척해낸다.
Elution buffer(EB)
: DNA를 씻어낸다. 고염조건에서 저염조건으로 바꾸어주어서 Cation bridge (나트륨이온)가 파괴, 그 결과 DNA 용출 가능하다. DNA는 염이 적어야 하고, 약염기(pH 7.5~9.5)에서 떨어져 나온다. (30μL때부터 회수율이 제대로 나오고, 30μL때 회수율과 양이 맞아 떨어져 가장 좋다)
Fragment DNA Binding(FB)
: Silica와 물의 수소결합을 약화시켜 물분자를 떨어져 나오게 하고, DNA와 Silica와의 결합을 유도하고, Agarose gel을 제거한다.
Absolute isopropanol
: DNA를 침전시켜 정제하고, 수율을 증가시키기 위해 사용한다.
DNA를 추출후 -20°C에 보관하는 이유
: 추출이 끝난 DNA는 변성되는 것을 막기 위하여 -20°C에서 냉동보관 한다.
100 μl의 Absolute ethanol을 첨가하는 이유
: 에탄올은 uncharge된 물질이며 체내에서 DNA는 (-)charge를 띤다. 따라서 물에 잘 녹기 때문에 에탄올을 넣어 물에 대한 친화력을 낮추어 원심분리하여 침전시킬 시, 침전이 잘 일어나도록 돕는 역할을 한다.
5분간 상온에 방치하는 이유
: DNA는 물이나 TE버퍼에 녹는다. 그래서 elution을 위해서 컬럼에 물이나 TE버퍼를 소량 넣어주어 elution(용출)한다. 효과적인 분리를 위해 일정시간 방치한다.
Chaotropic salt의 존재 하에서 silica 표면에 잘 결합하는 이유
: Chaotropic salt는 물질의 수소 이온 결합을 억제하는 물질을 통칭하는 것이다. 대표적으로 urea, guanidine등이며 Chaotropic salt는 DNA를 elution 할 때 (-)charge를 띠는 DNA가 column안에 있는 (-)charge의 silica 재질과 붙어있을 수 있도록 (+)charge로 연결시켜주는 역할을 한다.
7.2) 실험 시 주의사항
원심분리기를 사용할 때는 튜브를 넣을 때 그 배치가 대칭이 되도록 한다.
membrane에 남은 DNA를 확실히 없애주도록 하며, 물로 membrane에 있는 DNA를 녹여주는 작업을 여러 번에 걸쳐 나누어 반복해주도록 한다.
gel slicing시에 너무 바짝 잘라 DNA를 손실하지 않도록 주의하며, band와 band 사이의 간격이 좁아 다른 band의 DNA가 섞이는 경우가 생기지 않도록 전기영동을 충분히 시켜준다.
UV를 쪼일수록 DNA가 파괴되므로 UV를 최소화 시켜야 한다.
gel size가 비슷하지 않으면 balance가 맞지 않으므로 최대한 겔의 크기를 비슷하게 맞추어야 한다.
참고문헌
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https://www.ibric.org/myboard/read.php?id=192438&Board=exp_qna, 2021 년 10 월 16 일
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https://www.foodsafetykorea.go.kr/foodcode/01_03.jsp?idx=777, 2021 년 10 월 2 일
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www.mt.com/kr/ko/home/library/applications/lab-analytical-instruments/Uv-vis-dna- analysis.html, 2021년 10월 16일
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Gel Extraction,   생명공학실험,   DNA,   전기영동,   아가로스겔