생명분자공학실험

목차

1. Gel filtration chromatography &
Ion exchange chromatography를
이용한 LDH 단백질의 정제

2. 단백질과 DNA의 전기영동

3. 단백질과 DNA의 정량

4. LDH의 활성 방법

본문내용

2배 희석된 Folin reagent를 400μl 식 가한 후 상온에서 30분 동안 방치한다.
(5) 750nm에서 BSA 표준 시료와 측정하고자 하는 단백질 시료의 흡광도를 측정한다.
(6) Standard curve를 작성하고, 단백질 시료의 단백질 양을 구한다.
☞결과 및 토의
Bradfold assay & Lowry method 측정 실험
이번 실험은 Lowry method와 Bradford assay로 단백질의 농도를 측정해 보는 것이었다. 실험의 핵심은 reagent만들기와 흡광도를 재는 것이었다. reagent를 만들때는 BSA(알부민단백질)과 reagent를 혼합하여 흡광도를 재는 것이었다. Lowry method는 반응 시킨 후 1시간을 기다려야 했으므로 우리는 실험시간을 줄이기 위해서 그 사이에 비는 시간에 Bradford assay의 실험을 했다. 이 실험은 빨리하면 부정확하게 나올 가능성이 큰데 그 이유는 정확한 파이펫 사용이 가장 중요하기 때문이다. 파이펫의 정확한 사용은 BSA의 curve가 정확해지는 직접적인 원인이 될 것이다. Lowry method실험에서 흡광도를 잴 때에는 그 Lowry의 reagent를 다시 만들수는 있지만 1시간이나 지난 후 에야 쓸 수 있으므로 신중에 신중을 더 기해야 했다. Bradfold assay는 색을 통해서 반응을 알 수 있다. 595 nm 에서는 파란색을 띠고, 470 nm 갈색이나 붉은색을 띈다.
UV 측정값
260
0.176
280
0.184
위의 표는 단백질 정량 실험으로 단백질 흡광도를 260 nm와 280nm에서 측정한 값이다.
chap3. Lactate dehydrogenase (LDH)의 효소 활성 측정
☞ 실험 이론
Lactate dehydrogenase의 활성
Lactate dehydrogenase (lactic dehydrgenase, LDH)는 생체 내 거의 모든 기관에서 발견되는 효소로서 lactate를 pyruvate로 산화 시켜주는 역할을 한다. 또한 이 반응은 세포 내 에너지 발생의 근원이 되는 중요한 반응이기도 하다. LDH의 효소 작용을 살펴보면 arginine 171잔기는 lactate와 이온쌍을 형성하여 lactate를 잡아주는 역할을 하고 histidine 195 잔기는 염기로 작용하여 lactate의 수소를 제거하고 pyruvate로 환원 시켜 주는 역할을 한다. 조효소로 작용하는 NAD+는 2 개의 전자와 수소 이온을 받아 NADH로 환원된다. 이런 과정을 통해서 생체 내에서 전자를 이동시킨다. LDH에 의한 효소 반응은 가역적으로 일어 날 수 있다. 본 실험에서는 LDH와 pyruvate를 조효소 NADH와 반응시켜 pyruvate가 lactate로 환원되고 NADH 가 NAD+로 산화되는 반응을 실험 할 것이다. 효소의 선택적 특성에 따라 L-Lactate dehydrogenase는 L-Lactate에만 반응하여 pyruvate로 산화시킬 수 있으며 D-Lactate에는 반응하지 않는다. NADH는 340 nm에서 흡광도 값을 갖는다. 하지만 NAD+는 이 영역에서 흡광도 값을 보이지 않는다. 따라서 NADH를 340 nm에서 흡광도를 측정한 후 효소 반응을 진행시키며 흡광도가 감소하는 것을 측정하면 NADH가 NAD+로 바뀌는 양을 측정 할 수 있다.
☞ 실험 방법 & 기구 및 시약
→LDH 활성 실험 기구 및 시약
- UV-Vis Spectrophotometer
- Quartz cuvetter
- 100 mM Sodium phosphate 용액 (pH 7.5)
- 0.13 mM -NADH 용액
-NADH의 적당한 무게를 재서 100 mM Sodium phosphate 용액에 녹 여 제조한다.
- 34 mM Sodium pyruvate
Sodium pyruvate의 적당한 무게를 재서 100 mM Sodium phosphate 용액에 녹여 제조한다.
- 1.0% BSA 용액 (10 mg/ ml)
- Lactate dehydrogenase 용액
0.25~0.75 unit/ ml이 되도록 1.0 BSA 용액으로 희석하여 사용하기 바로전에 제조한다.
→LDH 활성 실험 방법
(1) 준비 해 둔 -NADH와 pyruvate 용액을 시료 준비 표와 같이 마이크로 튜브에 넣어 섞은 후 cuvette에 넣고 37℃, 340 nm에서 흡광도를 측정한다.
(2) -NADH와 pyruvate가 들어있는 (1)의 cuvette에 1.0% BSA와 LDH 용액을 각각 섞은 후 37℃, 340 nm에서 5분동안 흡광도의 변화를 측정한 다음 시간에 따른 흡광도 변화 (A340/ min.)를 구한다.
-NADH
pyruvate
1.0% BSA
LDH
Total Vol.
Test
2.8 ml
0.1 ml
-
0.1 ml
3.0 ml
Reference
2.8 ml
0.1 ml
0.1 ml
-
3.0 ml
* LDH assay 의 최종 농도 (전체 부피 3 ml)
- 100 mM sodium phosphate
- 0.12 mM -NADH
- 1.1 mM pyruvate
- 0.03% BSA
- 0.025~0.075 unit L-lactae dehydrogenase
☞결과 및 토의
LDH 활성
LDH은 밑의 식을 통해서 쉽게 알 수 있다. 이번 실험은 오른쪽에서 왼쪽으로의 반응식이다.
LDH
Lactate + NAD Pyruvate+NADH
Sample을 반응시켜서 가열을 하기 5분전과 5분후의 흡광도 측정값을 통해서 얼마만큼의 변화가 생겼는지를 관찰 할 수 있다. 변화가 생겼다면 흡광도의 차이가 크게 생길 것이고, 반응이 없다면 차이가 없을 것이다. 흡광도를 측정한 용액은 3가지를 만든다. 우선 Black인 pyruvate+NADH+증류수이고, 대조군으로써 pyruvate+BSA+NADH를 섞었다. 마지막으로 가장 중요한 실험군으로 pyruvate+NADH+LDH를 섞었다. 비교를 통해서 어느 용액이 얼마만큼의 반응이 있었는지 알 수 있다. 흡광도의 측정값이 작아진다는 것은 반응에 의해서 NAD+가 많이 생겼다는 것이고, 340nm 로 측정을 하면 실험군의 값이 변화했다.

키워드

생명공학,   분자실험,   생명,   단백질