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목차
1. 실험제목
2. 실험날짜
3. 제출자 및 공동실험자
4. 실험목적
5. 실험원리
6. 시약 및 기자재
7. 실험방법
8. 결과
9. 고찰
10. 참고문헌
11. Further study
2. 실험날짜
3. 제출자 및 공동실험자
4. 실험목적
5. 실험원리
6. 시약 및 기자재
7. 실험방법
8. 결과
9. 고찰
10. 참고문헌
11. Further study
본문내용
재어보니 0,18이었고 0.5ml stardard용액(4mg protein/ml)에 4.5ml의 Biuret reagent를 넣고 재니 0.12가 나왔다. Cuvett의 길이가 1cm라고 할 때, 희석하지 않은 단백질의 용액의 농도를 구하여라.
☞ Beer's law
A=εcl (ε : 몰흡광계수, c : 몰농도, l : cuvett의 길이)
* standard의 ε(몰 흡광계수) 구하기
Beer's law에 의해 A=0.12, l=1
0.12=ε×0.4×1
∴ ε=0.3
* 희석하지 않은 단백질의 농도
Beer's law에 의해 A=0.18, ε=0.3, l=1
0.18=0.3×c×1
∴ c=0.6mg/ml
이 때 이 단백질은 로 희석되었다. 즉 로 희석되었다.
그러므로 희석되지 않은 단백질의 농도는 0.6mg/ml×19=11.4mg/ml
∴ 11.4mg/ml
12. Further Study
protein 정량 method 3가지
ⅰ) Ultraviolet Absorbance of Aromatic Amino Acids
Ultraviolet Absorbance of Aromatic Amino Acids 방법은 방향족 아미노산인 phenylalanine, tyrosine, tryptophan에 의한 UV 흡수정도를 알아봄으로써 단백질을 정량한다. aromatic amino acid에 경우 410nm의 파장을 흡수하나 peptide 결합하에서는 낮은 파장인 210nm~225nm을 흡수된다. 측정범위는 20ug에서 3mg사이이다. 장점으로는 빠르고 sensitivity가 좋고, 단백질의 변성이 거의 없고 더 정확한 방법을 사용하기 전에 간단하게 단백질의 존재 유무를 확인할 수 있으며 column fraction에서 단백질을 확인하는데 적당한 방법이다. 단점으로는 buffer나 salt, 그 외의 다른 biological material에 영향을 많이 받고 주로 방향족 아미노산의 흡수도에 의존하므로, 샘플 단백질의 조성에 따라 차이가 많이 나므로 부정확할 수 있고 pH나 ionic strength에 의해서도 영향을 많이 받는다.
ⅱ) BCA (Bicinchoninic Acid) Assay
BCA Assay의 첫 번째 단계는 Cu2+가 Cu1+로 바뀌는 Biuret reaction이고, 두 번째 단계는 BCA가 Cu1+과 화합물을 형성해서 purple색을 내고 562nm에서 흡수되는 과정이다. BCA에 의한 단백질 측정 범위는 0.2~50ug이다. BCA의 장점으로는 사용되는 buffer에 의한 방해가 적으며 온도를 높이면 더 빠르게 반응하며 많은 다른 detergent와 함께 사용할 수 있고 사용하는 시약들이 안정하며 각 단백질간의 반응 변이차가 거의 없고 시약이 한 개만 필요하다는 것이다. 하지만 단점으로는 37℃나 상온에서는 반응이 완전하지 않으므로 많은 양의 단백질 정량 시에는 문제가 되며 농축된 단백질의 경우는 희석이 필요하고 반응시간이 40분에서 2시간정도로 반응이 느리게 일어나며 단백질이 비가역적으로 변성되어 다시 사용할 수 없다.
ⅲ) Kjeldahl법에 의한 단백질 정량
kjeldahl법은 단백질의 총 질소량을 정량하는데 사용되는 방법이다. 단백질을 촉매의 존재하에서 진한황산과 오랫동안 끓이면 질소가 모두 (NH4)2SO4로 되는데, 이 혼합물의 일정량에 과량의 NaOH를 넣고 증류하여 이 때 발생되는 암모니아를 H3BO3용액에 흡수시킨 후 표준 산 용액으로 적정하여 암모니아의 양을 측정할 수 있고, 또한 질소의 양도 측정 할 수 있다. 단백질은 평균적으로 16%의 질소를 포함하고 있으므로 측정된 질소의 양을 알면 대략적인 단백질의 양을 알 수 있다.
☞ Beer's law
A=εcl (ε : 몰흡광계수, c : 몰농도, l : cuvett의 길이)
* standard의 ε(몰 흡광계수) 구하기
Beer's law에 의해 A=0.12, l=1
0.12=ε×0.4×1
∴ ε=0.3
* 희석하지 않은 단백질의 농도
Beer's law에 의해 A=0.18, ε=0.3, l=1
0.18=0.3×c×1
∴ c=0.6mg/ml
이 때 이 단백질은 로 희석되었다. 즉 로 희석되었다.
그러므로 희석되지 않은 단백질의 농도는 0.6mg/ml×19=11.4mg/ml
∴ 11.4mg/ml
12. Further Study
protein 정량 method 3가지
ⅰ) Ultraviolet Absorbance of Aromatic Amino Acids
Ultraviolet Absorbance of Aromatic Amino Acids 방법은 방향족 아미노산인 phenylalanine, tyrosine, tryptophan에 의한 UV 흡수정도를 알아봄으로써 단백질을 정량한다. aromatic amino acid에 경우 410nm의 파장을 흡수하나 peptide 결합하에서는 낮은 파장인 210nm~225nm을 흡수된다. 측정범위는 20ug에서 3mg사이이다. 장점으로는 빠르고 sensitivity가 좋고, 단백질의 변성이 거의 없고 더 정확한 방법을 사용하기 전에 간단하게 단백질의 존재 유무를 확인할 수 있으며 column fraction에서 단백질을 확인하는데 적당한 방법이다. 단점으로는 buffer나 salt, 그 외의 다른 biological material에 영향을 많이 받고 주로 방향족 아미노산의 흡수도에 의존하므로, 샘플 단백질의 조성에 따라 차이가 많이 나므로 부정확할 수 있고 pH나 ionic strength에 의해서도 영향을 많이 받는다.
ⅱ) BCA (Bicinchoninic Acid) Assay
BCA Assay의 첫 번째 단계는 Cu2+가 Cu1+로 바뀌는 Biuret reaction이고, 두 번째 단계는 BCA가 Cu1+과 화합물을 형성해서 purple색을 내고 562nm에서 흡수되는 과정이다. BCA에 의한 단백질 측정 범위는 0.2~50ug이다. BCA의 장점으로는 사용되는 buffer에 의한 방해가 적으며 온도를 높이면 더 빠르게 반응하며 많은 다른 detergent와 함께 사용할 수 있고 사용하는 시약들이 안정하며 각 단백질간의 반응 변이차가 거의 없고 시약이 한 개만 필요하다는 것이다. 하지만 단점으로는 37℃나 상온에서는 반응이 완전하지 않으므로 많은 양의 단백질 정량 시에는 문제가 되며 농축된 단백질의 경우는 희석이 필요하고 반응시간이 40분에서 2시간정도로 반응이 느리게 일어나며 단백질이 비가역적으로 변성되어 다시 사용할 수 없다.
ⅲ) Kjeldahl법에 의한 단백질 정량
kjeldahl법은 단백질의 총 질소량을 정량하는데 사용되는 방법이다. 단백질을 촉매의 존재하에서 진한황산과 오랫동안 끓이면 질소가 모두 (NH4)2SO4로 되는데, 이 혼합물의 일정량에 과량의 NaOH를 넣고 증류하여 이 때 발생되는 암모니아를 H3BO3용액에 흡수시킨 후 표준 산 용액으로 적정하여 암모니아의 양을 측정할 수 있고, 또한 질소의 양도 측정 할 수 있다. 단백질은 평균적으로 16%의 질소를 포함하고 있으므로 측정된 질소의 양을 알면 대략적인 단백질의 양을 알 수 있다.
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- 등록일2008.04.21
- 저작시기2007.3
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- 자료번호#461971
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