Ex6_Specific_ activity_and_enzyme_kinetics_of_alkaline_phosphatase

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본문내용

한다.
3) AP의 Enzyme Kinetics
① 1mM PNPP 용액을 연속적으로 희석하여 500, 250, 100, 50, 25, 12.5, 6.25M 용액을 준비한다.
② 준비한 각 농도의 PNPP 1㎖에 AP효소 10㎕를 넣고 voltexing하여 1min 반응 후 1N NaOH를 50㎕ 가하고 voltexing하여 반응을 멈추게 한다.
→ pH를 변화시켜서 enzyme의 활성을 없애주기 위해 NaOH를 넣어준다. NaOH를 넣기 전에 1min씩 똑같이 반응을 해야하기 때문에 효소를 넣은 순서대로 NaOH를 넣어준다.
③ 410nm에서 흡광도를 측정한다.
④ 각 기질농도에서 단위시간 동안의 흡광도 변화로부터 초기속도를 계산하고 기질농도 vs 초기속도를 plot한다.
④ Lineweaver-Bu가 plot으로부터 Km, Vmax값을 계산한다.
⑤ AP효소의 turnover number(Kcat)을 계산한다.
Results
① A595를 측정하여 표를 완성하고 BSA standard curve와 비례식으로부터 시료의 농도를 계산한다.
② 측정된 A410 값으로부터 생성된 PNP양을 계산하여 정제 전후의 AP의 specific activity를 비교한다.
흡광도
0.426
0.135
0.174
0.143
sample농도
6.808
2.152
2.776
2.28
PM흡광도
(A595)
1.019
sample흡광도
(A595)
0.728
0.767
0.736
PM농도
(㎍/㎕)
3.4
sample농도
(㎍/㎕)
1.08
1.39
1.14
PM
(1㎍/㎕)
0.3
sample
(1㎍/㎕)
0.9
0.7
0.9
410nm흡광도
Specific activity
효율
PM
0.539
0.03028089
-
50
2.151
0.120842696
399.07
100
1.646
0.09247191
305.38
150
0.710
0.03988764
131.725
③다양한 기질농도에서 측정한 흡광도 변화로부터 초기속도를 계산하고, 기질농도vs초기속도를 plot한다.
[S](M)
초기속도(V0)
△A410/min
M/min
0
6.25
0.347
1.95×10^1
12.5
0.518
2.91×10^1
25
1.184
6.65×10^1
50
1.785
1.00×10^2
100
2.307
1.30×10^2
250
2.307(*)
1.30×10^2(*)
500
2.307(*)
1.30×10^2(*)
[S](M)
V0(M/min)
1/[S], (1/M)
1/V0(min/M)
6.25
1.95×10^1
0.16
0.051
12.5
2.91×10^1
0.08
0.034
25
6.65×10^1
0.04
0.015
50
1.00×10^2
0.02
0.01
100
1.30×10^2
0.01
0.0077
250
1.30×10^2(*)
0.004
500
1.30×10^2(*)
0.002
⑤ AP효소의 turnover number(Kcat)을 계산한다.
turnover number(Kcat) = 16600.27
<풀이방법은 Discussion 참조>
Discussion
-결합하는 색소의 양이 단백질의 양에 비례하기 때문에 흡광도를 이용하여 단백질의 양을 구할 수가 있다. 우리가 한 실험은 농도를 알고 있는 단백질 표준용액을 농도별로 만들어 시료와 동일한 조건에서 발색시키고, 각각의 흡광도를 구해 BSA 표준 곡선을 작성하여 일차함수식을 구한 뒤(여기까지는 조교분들이 완성) 그 식을 이용하여 미지의 시료에 들어있는 단백질의 양을 구하고 그 자료를 이용해 다양한 값을 얻는 것이었다.
-Kcat은 turnover number. 말 그대로 대사 회전수라고 말한다. 즉 단위 시간당 substrate를 product로 옮기는 분자수를 말하며 속도와 비슷한 의미를 갖는다. Km은 효소와 기질에서 product를 만들어내는 반응식을 정류상태가정 식을 이용하여 풀었을 경우 나오는 것으로 Km=(K-1+K2)/K1이다. 여기서 K-1>>K2로 놓으면 Km=K-1/K1로 간단히 놓을 수 있다. 즉, Km이 클 경우 efficiency가 작아 기질과의 결합이 약하다고 볼 수 있고, Km이 작을 경우 efficiency가 커서 기질과의 결합이 강하고, product를 잘 생성한다고 볼 수 있다. 결국 Kcat이 크고, Km이 작을수록 enzyme과 결합을 잘하고, product로 잘 간다고 볼 수 있다.
-중간과정에서 NaOH를 넣어주는 이유는 enzyme의 활성을 없애기 위해서이다. 시간이 지나면서 효소랑 기질이 너무 많이 결합을 하게 되기 때문에 흡광도가 너무 커져서 기계가 읽을 수 있는 한도를 초과하게 된다. 그러므로 NaOH를 넣어 pH를 변화시켜서 enzyme의 활성을 없애준다. NaOH를 넣기 전에 1min씩 똑같이 반응을 해야 하기 때문에 효소를 넣은 순서대로 NaOH를 넣어준다.
-흡광도 410을 사용하는 이유는 PNPP가 PNP로 변할 때 PNP물질이 410nm파장을 흡수하기 때문에 410nm를 사용한다.
-6,7의 흡광도가 ***로 표시되는 이유는 기계가 흡광도 3이 넘으면 읽을 수 없기 때문이다. 그리고 1→7로 갈수록 흡광도가 높아지는 것은 잘 된 실험이다. 기질의 농도가 높아질수록 효소의 반응이 커지기 때문에 흡광도가 높아지는 것은 당연한 것이다.
-원심분리기를 사용할 때에는 물론 잠깐이긴 하지만 원심력에 의해 용액이 모두 밑으로 내려갈 수 있을 정도로 사용되어야 한다. 실제로 우리 조는 원심분리기를 너무 짧게 사용해서 마이크로튜브 뚜껑에 용액이 그대로 묻어 있어서 원심분리를 한 번 더 했다. 정량을 하는 것이 중요한 실험인 만큼 다음부터는 조심해야겠다. 또한 원심분리기를 사용할 때 양쪽 대칭을 맞춰서 사용해야 한다. 원심분리기는 중심축을 기준으로 고속회전을 하기 때문에 무게를 대칭 되도록 사용하여야 떨림이 없다.
Reference
http://en.wikipedia.org/wiki/Beer%E2%80%93Lambert_law
http://en.wikipedia.org/wiki/Alkaline_phosphatase
http://en.wikipedia.org/wiki/enzyme_kinetics

키워드

alkaline phosphatase,   enzyme kinetics,   PNPP,   PNP,   Specific activity of enzyme,   Michaelis-Menten enzyme kinetics,   Beer,   Specific activity