식물조직 배양 및 실험 PCR의 원리와 특징

소개글

식물조직 배양 및 실험 PCR의 원리와 특징에 대한 보고서 자료입니다.

목차

Ⅰ. 원하는 유전자준비
1) GeneBank에서 유전자 검색
2) Genominc DNA분리
3) Polymerase Chain Raction(PCR)
* PCR에서 필요한 재료
* PCR 의 원리
① DNA의 변성(denaturation)
② Primer의 결합(annealing)
③ DNA의 합성(polymerization)
4) PCR의 산물의 전기영동(electrophoresis)
PCR product purification

Ⅱ. 얻은 유전자를 vector에 삽입
1) Vector
※ Vector의 기능
※ Vector의 종류
2) Restriction enzyme
※ Recombinant DNA
※ 제한효소 (restriction enzyme)
3) DNA ligation과 T-vector를 이용한 PCR product의 cloning

Ⅲ. 유전자가 삽입된 DNA를 세포 내로 주입
1) Transformation
2) 항생제와 LacZ를 이용한 seletion
※ 항생제를 이용한 selection
LacZ를 이용한 color selection

Ⅳ. 올바른 clone 선택
1) Plasmid DNA 분리
2) Restriction enzyme mapping
3) DNA sequencing
※ DNA sequencing의 원리
4) Gene cloning의 결과

본문내용

나 glucose가 첨가되어 세포의 형태를 유지하도록 하는데 lysozyme을 쓰기도 한다.
② 세포막을 조심스럽게 깨서 크기가 큰 chromosomal DNA가 너무 잘게 조각나는 것을 방지하면서 용액에 DNA를 노출시킨다. SDS라는 detergent가 세포막을 녹여버리면서 안에 있던 세포 내용물이 용액으로 흘러나오게 되는데 이때 alkali 용액에 노출된 DNA 는 모두 denature 되지만 크기가 작은 supercoiled plasmid DNA는 그다지 심각하게 되지 않는 성질을 이용하는 것이다.
③ pH를 급격히 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적 renaturation이 잘 되지만, chromosomal DNA는 미처 renature되지 못하고 엉기게 되는데 이렇게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리로 제거한다. 그러면 상층액에 plasmid DNA가 있게 된다.
Supercoiled (closed circular) DNA와 open circular DNA
분리한 DNA를 그대로 전기영동하면 분리가 아주 잘 되면 대부분 supercoiled form DNA만 보이지만 분리과정에서 작은 충격을 입어서 open circular form이 조금 나타날 수도 있다.
보통 DNA는 supercoiled form으로 존재하지만, 한쪽 strand에 nick이 생기면 supercoil이 풀어져서 open circular form이 된다. 실제로 같은 DNA가 supercoiled, linear, open circular form으로 존재할 수 있는데, 이들을 전기영동하면 같은 염기서열의 같은 크기 DNA라도 이동하는 거리가 제각기 다르다. Size marker로 쓰는 짧은 DNA는 linear form이므로 전기영동으로 size를 비교할 수 있는 DNA는 linear form DNA 뿐이다.
2) Restriction enzyme mapping
분리한 DNA를 제한효소로 처리하여 원하는 DNA가 삽입되어 있는지를 확인한다.
실험에서 사용한 DNA의 염기서열을 알고 있기 때문에 제한효소를 처리하면 우리가 원하는 DNA가 맞는지를 확인이 가능하다.
제한효소처리 후 한쪽 끝에 size marker를 넣고 전기영동 하여 size를 비교해서 크기가 예상한 것과 같으면 거의 99% 원하는 DNA라고 볼 수 있다.
3) DNA sequencing
Insert가 존재하면 99% 원하는 DNA가 맞지만 같은 크기의 다른 DNA가 들어있을 가능성도 없다고 할 수 없으므로 gene cloning과 subcloning의 마지막에는 반드시 DNA sequencing으로 염기서열의 일부라도 확인해야 한다.
DNA sequencing의 원리
① Denaturation of template DNA
Double strand DNA를 쓰는 경우 pH를 높여 주거나 열을 가하여 DNA를 변성시키고, 이 상태로 침전하는 과정을 말한다.
② Annealing of the primer
DNA polymerase의 기본 작용 조건은 template와 primer가 있어야 한다는 것이다. 따라서 template DNA 내에 일부 염기서열을 알고 있어야하지만 primer를 합성하여 쓸 수 있는데, plasmid를 사용하는 경우 vector의 multiple cloning site 부근에 해당하는 primer를 쓸 수 있으므로 대단히 편리하다. 이 과정에서는 적당한 온도와 반응 조건에서 template와 primer가 결합하게 된다.
③ Labeling reaction
이 과정에서는 나중에 형성된 산물들이 모두 방사성 동위원소로 표지 되어 X-ray 필름에 노출 시 감광 되어 눈으로 확인할 수 있게 하는 과정이다. 가능한 한 생성되는 모든 DNA 산물에 동위원소를 표지하기 위해서 DNA polymerase에 의한 DNA chain 합성과정에서 우선적으로 동위원소가 표지 된 nucleotide가 들어갈 수 있도록 조건을 정해주고 있다.
④ Extension / termination reaction
모든 chain에 동위원소가 표지 된 후 적당 비율의 deoxynucleotide (dNTP)와 dideoxynucleotide (ddNTP)에 노출시켜 각 반응 중에 DNA chain이 합성되기도 하고(extension), ddNTP가 들어가면 중지 (termination)되기도 하게 조건을 정해주었다. 한 tube에서 한 종류의 ddNTP (예, ddCTP)를 넣어준다면 그 tube에는 모두 ddCTP로 끝난 DNA 산물을 가지게 되므로 이를 전기영동 하여 template 상에 G (상보적인 strand는 C)가 어느 부위에 있는지를 파악할 수 있게 된다.
⑤ Stop reaction과 전기영동
모든 반응을 정지시키고, 이를 denaturing polyacrylamide gel에서 전기영동 한다. 이 전기영동은 단지 한 개의 nucleotide 차이에 의한 이동속도의 구별이 될 수 있도록 민감하게 디자인되어있다.
4) Gene cloning의 결과
clone 보관방법
Bacterial Stock
Sequencing에서 확인된 colony를 LB 배지에 배양한 후, glycerol을 10∼50% 첨가하여 cryotube 에 넣어 -70 C 이하에서 냉동보관 하고 자주 써야하는 clone은 streaking 해놓고 냉장 보관해 사용한다. 한달이상 보관하지 않고 계대배양 한다. 또한 DNA를 분리하여 얼려 보관한다. DNA는 잘못 분리하거나 잘못 보관하면 다른 불순물이 섞이거나 깨지는 수가 있으나 DNA를 보관해 두는 것이 좋다.
균주 목록의 작성
만든 clone은 보관상자 가로, 세로줄에 번호를 붙여 보관하고 그 번호에 관해 따로 자세히 기록노트를 보관한다. 예를 들면 균주의 이름을 정하고 보관 날짜를 쓰고, 어느 상자에 보관되어있는지를 기술하고, 또 competent cell은 어떤 균주를 썼는지, 어떤 방법으로 어떻게 cloning한 것인지, vector는 무엇인지, 그리고 마지막에 plasmid map을 작성한다.

키워드

gene cloning,   Genominc DNA,   PCR,   VECTOR,   식물조직배양,   Plasmid DNA