<실험>유전자 재조합에 의한 단백질 과량발현 및 분석

소개글

<실험>유전자 재조합에 의한 단백질 과량발현 및 분석에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. Introduction
<단백질의 과량 발현>
<과량 발현된 단백질의 분석>

2. Procedures

3. Results
(1) SDS-PAGE
(2) PCR

4. Discussion

본문내용

cles
3' primer(10nmole/ml) 1 5 72 ℃ 30 sec
(×10) buffer 2 60 72 ℃ 10 min
2.5 mM dNTP 2 60 4 ℃
18 108
1. #1-5 tube에 18㎕씩 aliquoting
2. 각 tube에 protein sample(100ng/㎕) 2㎕씩 첨가, PCR 수행
(2) Agarose gel electrophoresis
A. 1% Agarose gel mixture
Agarose 1 g
TAE Buffer 100 ml
1. microwave 1 min
2. Etbr(5mg/ml) 10 ㎕ 넣고 붓기
B. loading sample 준비, gel running
1. PCR mix 20 ㎕에 (X6) loading buffer 4 ㎕ 첨가
2. sample loading
3. 80 V 30 min, UV illuminator로 확인
3. Results
(1) SDS-PAGE (2) PCR
4. Discussion
(1) SDS-PAGE
- SDS-PAGE는 기본적으로 우리가 원하는 단백질이 과량발현을 했는지를 target size의 band intensity 증가 여부로 확인할 수 있다. 이번 실험에서 과량 발현 단백질은 taq DNA polymerase 이고, 과량 발현 유도과정은 lac operator에 의한 IPTG induction이다.
왼쪽에서부터 1은 marker(M)이고 2,3,4,5번 밴드는 total Cell의 다양한 단백질들이 모두 들어있어서 밴드가 전 구간에 걸쳐 진하게 표현되어지는 것을 볼 수 있다. 2,3번 보다 4,5번 밴드에서(특히 5번) 약 94kDa 위치에 좀더 진하게 발현된 것도 볼 수 있다.
75°C에서 1시간동안 Heat treatment로 lysate한 6,7,8,9는 E.Coli Protein이 모두 변성 되고(37°에서) taq DNA polymerase만 높은 온도에서도 안정하게 남아있는 결과이다. 6,7번은 taq gene이 없어서 단백질의 발현을 거의 볼 수 없었다. 하지만 일부 약하게 나타나는 밴드는 basal level로서 발현되어진 것을 보여준다. 9번은 이번 실험의 목적인, IPTG induction에 의해 lac operon 활성화로 원하는 단백질이 증폭되어 발현 된 것을 보여준다. 확실히 다른 밴드들과 비교해 봤을 때 94kDa 위치에서 과량발현이 이루어 졌음을 확인할 수 있었다. 8번은 taq gene이 있고 induction되지 않은 것인데, 94kDa 부근에서 밴드가 약하게 나타난다. 이는 lac operon이 inducer가 없어도 어느 정도는 expression될 수 있다는 것을 말해준다.
10번은 양성 대조구로서 purified taq을 나타낸다.
(2) PCR
- PCR은 과량 발현된 단백질이 높은 활성(activity)을 보이는지를 나타내준다.
M은 1 kb ladder Marker를 사용하였고, VI는 taq polymerase를 코딩하는 gene이 없으므로 primer만 나타나고, taq 은 나타나지 않았다. TI은 induction되어 과량 발현된 taq DNA polymerase의 활성으로 생성된 taq gene이 PCR을 통해 증폭이 이루어졌기 때문에 진한 밴드가 보이고 있다. 또, TI를 1㎕를 넣어준 것 보다 2㎕를 넣어 주었을 때 2㎕속에 존재하는 taq DNA 양이 2배로 더 많으므로 더 진하게 보이고 있음을 알 수 있다. 이로써 우리가 원하는 이들 단백질이 높은 활성을 띄고 있다는 사실을 유추할 수 있다.
5. Reference
- http://biosci.snu.ac.kr/(실험 게시판)

키워드

단백질,   과량발현,   단백질 분석,   단백질 안정도,   SDS-PAGE,   PCR