벡터 (Vector)

목차

1. 플라스미드 벡터

2. 파아지 벡터

3. 람다 파아지 벡터

4. 코스미드

5. M13 파이지 벡터

6. 파아지미드

본문내용

터를 이용하여 사람 게놈 라이브러리를 만들기는 어렵다. 그 이유는 세균이 작은 크기의 플라스미드라도 받아들이기 때문이다. 그러므로, 대부분의 클론은 몇 천개나 심하면 몇 백개의 DNA만을 가지고 있을 수 있다. 이러한 라이브러리가 완전하기 위하여는 수백만 개의 클론이 필요하다.
EcoRI은 대략 4kb 정도의 DNA 조각을 만들어 내나, 람다 벡터는 12kb 이하의 DNA를 받아들이지 않으므로, DNA를 EcoRIdl나 대부분의 제함효소는 진핵세포 유전자의 가운데를 적어도 한번이상 절단할 수 있으므로 이 효소로 모든 인식부위를 절단하면 대부분 유전자의 일부만을 얻게 될 것이다. 이러한 문제를 해결하기 위하여 EcoRI으로 불완전하게 절단할 수 있다. 만약 효소가 4-5개의 인식 부위 중의 하나만을 절단한다면 평균적으로 절단된 분자의 크기는 16-20kb 정도가 될것이고 이정도 크기면 벡터가 받아들일 수 있고, 대부분의 진핵세포 유전자를 한 클론에 포함할 수 있는 정도이다. 만약 좀 더 다양한 DNA 조각을 원한다면 제한효소를 이용하는 대신 초음파를 이용하여 DNA를 기계적으로 잘라서 클로닝에 이용할 수 있다.
게놈라이브러리는 매우 유용하다. 일단 한번 만들어지면 원하는 어떤 유전자라도 찾을 수 있다. 그러나 이 라이브러리에는 어떤 목록도 없기 때문에 우리가 관심 있는 유전자가 있는 클론이 어디 있는지 찾기 위하여 탐침을 이용해야 한다. 이상적인 탐침은 찾고자 하는 유전자의 염기서열과 맞는 표지된 핵산분자이다. 이를 이용하여 수천개의 람다파아지의 DNA에 잡종화시키는 플라크 잡종화 방법을 수행한다. 표지된 탐침과 결합하는 DNA를 가진 프라크가 원하는 클론이다.
그림 4.9는 어떻게 플라크 잡종화를 하는지를 설명하고 있다. 각 배양판에 수천개의 플라크를 키운다(물론 이 그림에는 간단하게 몇 개만을 표시하였다). 다음으로 DNA에 결합할 수 있는 니트로셀로로오스나 나일론으로 만든 필터를 배양판 표면에 살짝 댄다. 이 방법으로 각 플라크에 있는 DNA를 필터로 옮길 수 있다. DNA를 알칼리로 변성시키고 표지한 탐침으로 잡종화한다. 이 탐침이 원하는 DNA를 가진 클론과 만나면 상보적인 DNA끼리 결합하여 DNA가 있는 곳을 표지할 것이다. 이렇게 표지된 지점을 X-선 필름으로 찾아 낼 수 있다. 필름에 나타난 검은 점이 바로 우리가 원하는 유전자를 가진 플라크가 원래 배양판의 어디에 있는지 나타낸다. 실제로 원래의 배양판에는 많은 수의 플라크가 몰려 있기 때문에 원하는 것을 찾기가 어려우므로, 그 주위에서 여러 플라크를 딴 뒤 농도를 낮춰 다시 배양하고 잡종화작업을 다시 반복하여 맞는 클론을 찾는다.
그림 4.9
4. 코스미드
크기가 큰 DNA를 클로닝하는 또 다른 벡터는 코스미드벡터이다. 코스미드는 플라스미드와 파이지의 성격을 가지고 있다. 즉 람다 파아지 DNA의 cos 부위, 점착성말단을 가지고 있어 DNA가 람다 파아지의 머리로 포장될 수 있다. 이들은 또한 플라스미드의 복제원점을 가지고 있어, 세균에서 플라스미드처럼 복제할 수 있다.
이 벡터는 람다 DNA중에서 cos부위를 제외한 모든 부위가 제거되어 있기 때문에 크기가 매우 큰(40-50kb) 외부 DNA가 들어갈 수 있다. 일단 이러한 DNA가 들어가면 재조한 DNA는 파아지 입자로 포장될 수 있다. 그러나 이 파이지 입자는 복제에 필요한 DNA가 없기 때문에 파아지로서 복제할 수는 없지만, 감염성은 높아 재조합 DNA를 세균안으로 이동시킬 수는 있다. 일단 세포안에 들어가면 DNA는 플라스미드의 복제 원점을 이용하여 플라스미드로 복제한다.
5. M13 파이지 벡터
클로닝에 이용하는 또 다른 파아지는 필라멘트 파이지인 M13 파이지 벡터이다. 조나단 메싱과 동료들은 파아지 DNA에 pUC벡터에 있는 것과 같은 -갈락토시다제 유전자와 MCS를 넣었다. 실제로 M13 파이지를 먼저 제조하고 pUC 플라스미드에 있던 유용한 MCS를 간단히 이동한 것이다.
M13 파이지 벡터의 장점은 게놈 단사 DNA이므로, 이 벡터에 클로닝된 DNA는 단사 상태로 추출할 수 있다. 이 장의 뒤에서 배우겠지만, 단사 DNA는 특정한 위치에 원하는 돌연변이를 집어넣는 위치지정돌연변이를 제조하는데 필요하다. 또한 단사 DNA는 DNA의 염기서열을 결정하기 쉽도록 한다.
그림 4.10에는 어떻게 이중사 DNA를 M13에 크로로닝하고 단사 DNA를 추출하는지를 보여준다. 파이지 입자의 DNA 자체는 단사이나, 대장균에 감연한 후 이중사 복제형으로 전환된다. 이 이중사 RF 파아지 DNA가 우리가 클로닝에 이용하는 DNA이다. 이 DNA를 MCS에 있는 한 두 개의 제한효소로 절단하고 같은 효소분위를 이용하여 외부 DNA를 삽입한다. 그 후 이 재조합 DNA를 숙주세포에 감염하고, 단사형태의 재조합 DNA를 가지고 있는 파아지를 만들어낸다. 파이지 DNA를 가지고 있는 이 파아지 입자는 세포로부터 분배되므로 이를 배양액에서 추출하면 된다.
그림 4-10
6. 파아지미드
단사 DNA를 만들 수 있는 또 다른 종류의 벡터들이 개발되었다. 이들은 코스미드와 같이 파아지와 플라스미드의 성격을 모두 가지고 있기 때문에 파아지미드라고 부른다. 매우 자주 쓰이는 종류로 pBluescript(pBS)가 있다(그림 4.11) pUC벡터처럼, pBluescript는 lacZ' 유전자 중간에 MCS가 있어서 외부 DNA가 들어간 군체는 X-gal이 존재할 때 파란색이 아니라 하얀색으로 구별할수 있다. 이 벡터는 M13과 같은 단사 파아지인 f1의 복제기점을 가지고 있다. 그러므로 제조합 파아지미드를 가지고 있는 세포는 f1 헬퍼(helper) 파아지에 감염되면 단사 파아지미드 DNA를 만들어 포장할 수 있다. 또한 이 벡터에는 MCS가 두 종류의 파아지 RNA 전사효소에 대한 프로모터를 가지고 있다. 예를 들어 pBS는 T3 프로모터와 T7프로모터를 서로 반대 방향으로 가지고 있다. 이를 이용하면 이중사인 파이지 DNA를 분리하여 시험관에서 둘 중 한 가지 RNA 전사효소를 이용하여 전사시키면 각 방향의 RNA를 순수하게 생산할 수 있다.
그림 4-11

키워드

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