DNA sequencing 원리 종류 역사

목차

DNA sequencing
≪ 화학적 방법 ≫
≪ 효소적 방법 ≫
≪ 자동 염기서열 분석장치 ≫

본문내용

에 이러한 단점을 극복할 수 있는 새로운 분석 체계가 모색되어 왔다.
기존의 염기해석 방법들과는 다르게 hybridization 방법을 응용한 새로운 방법이 최근에 개발되었다. 이는 최근에 개발된 combinatorial chemistry 기술과 반도체 기술을 이용한 것으로서, 고밀도의 DNA chip 상에서 hybridization을 수행하는 것이다.
Sequencing by Hybridization(SBH)은 1988년 전통적 DNA sequencing 방법의 대안으로 제시되었다. 이 SBH의 기본 개념을 그림에 나타내었다.
예를 들어 모든 가능한 서열을 모두 포함하고 있는 65,536(48) 종류의 octanucleotide 탐침 배열 칩에 12-mer의 표적 DNA를 넣어 혼성화하였다고 가정하자. 완전하게 상보적인 탐침은 표적 DNA 상의 1-8, 2-9, 3-10, 4-11, 5-12 서열과 상보적인 탐침 5 가지 뿐이다. 이들 5 종류의 탐침 서열을 중첩시키면 표적 DNA의 상보적인 서열을 알아낼 수 있다.
실제로 16.6 kb의 인체 미토콘드리아의 염색체를 136,528 종류의 탐침 배열을 사용하여 한번의 혼성화 실험으로 미토콘드리아의 전체 염기서열을 해석할 수 있었다. 또한 환자의 시료로부터 미토콘드리아 DNA의 돌연변이를 관찰할 수 있었고, 특히 자주 일어나는 염기서열 다형성의 비율까지 알아낼 수 있었다.
보통의 전기영동 방법으로 한 lane에서 400개 염기씩 읽으면서 48 lane을 한번에 전기영동하고, 하루에 두번 전기영동을 한다면, 미토콘드리아 염색체 전체의 염기서열을 결정하는데 하루가 걸린다. 반면에 이 새로운 방법으로는 한시간에 5번 hybridization이 가능하기 때문에, 한번에 2개씩 한다면 하루에 50개 샘플의 미토콘드리아 염색체의 전체 염기서열을 결정할 수 있다. 이러한 장점 뿐만 아니라, 전체 유전체 염기서열을 한번의 실험으로 완성할 수 있으며, 전기영동기기와 같은 특수한 분석 기기가 필요 없고, 수분내에 전체 염기서열을 읽어낼 수 있다. 보통 2.5 kb의 염기서열을 결정하는데 드는 비용, 노력, 시간으로 16.6 kb의 염기서열을 결정할 수 있어서 6배 이상의 개선 효과가 있다.
polyarylamide gel electrophoresis
ABI 373 DNA sequencer는 형광표지된 DNA 를 4.75% polyacrylamide gel에 loading 시켜 laser window를 통과시켜 각각 4 color를 인지하여 분석한다. 이 형광표지 DNA signal은 macintosh quadra 675의 Data collection software 를 이용하여 감지되고 sequece analysis software로 최종 분석평가를 한다. 그리고 Data는 각각의 base가 4가지 color peak로 표시된 Color printer 용지로 받아볼 수 있다. 한 lane의 reaction으로 약 300-400 base를 읽을 수 있으며, miscall은 1.5% 미만이다.
capillary electorphoresis
ABI 310 DNA 염기서열 자동 분석기는 형광표지된 DNA를 capillary를 이용하여 laser window를 통과시켜 각각 4 color를 인지하여 분석한다. ABI 373 DNA Sequencer에 비해 reaction에 사용하는 효소의 sensitivity가 훨씬 증대되었으므로 소량의 DNA로도 동일한 data를 얻을 수 있으며, 전기영동 후 1시간 뒤에 바로 data분석이 가능하다. 한번의 reaction으로 약 450-500bp를 읽을 수 있다.
postelectrophoresis capillary scanning (PECS)
DNA 염기서열 결정의 단위시간당 시료 처리량 즉 throughput을 향상시키기 위하여 postelectrophoresis capillary scanning (PECS) 방법을 개발하였다. 이 방법은 모세관 전기영동에 의한 DNA 염기서열결정 반응물의 분리와 분리된 시료의 분석을 시간과 공간적으로 분리시키는 것을 특성으로 하고 있다. DNA 시료 분석을 위해 two-window-four- channel 레이저 유발형광 검출장치를 가지는 모세관 스캐너를 제작하였다. PECS 방법을 기초로 제작된 모세관 스캐너는 throughput 에서 기존의 자동화된 DNA 염기서열 결정기기보다 수백배 향상된 성능을 가질 수 있어 이 방법을 이용하면 염기서열 결정에 필요한 시간과 비용을 크게 줄일 수 있다.
Cycle sequencing
1. subcloning이 필요 없다.
2. 매우 적은 양의 DNA만 필요
3. gel pattern이 매우 깨끗하다.
4. primer의 non-specific binding이 적다.
Cycle sequencing법은 DNA 염기서열 결정법으로 널리 사용되어지고 있는 Sanger법 (dideoxy법)에 PCR의 방법을 적용한 획기적인 반응법이다. Heat denature→Primer annealing→Polymerase extension을 반복하므로써 아래와 같은 이점을 갖는다.
1) 주형 DNA를 반복하여 사용하기 때문에 5~10 fmol 정도의 DNA로 해석 가능하다.
2) 반응온도는 72℃로 높기 때문에 DNA의 2차 구조의 형성을 억제하여 정확한 상보성 가닥을 합성할 수 있다.
3) ds DNA를 그대로 주형으로서 사용할 수 있다. 특히 PCR 산물로부터 직접 염기서열 결정 가능 (Direct sequencing).
≪ Sequencing primer의 설계 ≫
1. 15 개 이상 (18-24 residues)
2. A, T, G, C가 비슷하게 나타나도록 함 (G + C 함량은 40-50%)
3. 같은 뉴클레오티드가 3개 이상 계속적으로 나타나지 않도록 함
4. 이차구조 또는 자가 상보성이 나타나지 않도록 함
5. 3' 말단이 C 또는 G가 되도록 함
6. Tm이 50-55℃가 되도록 함
(Tm = 69.3 + (0.4)(% G+C)-(650/L), L is the length of the primer)

키워드

DNA sequencing,   DNA염기서열분석법,   Maxam-Gilbert의 염기서열 분석법,   자동 염기서열 분석장치,   Sanger의 방법