Cell Culture

소개글

Cell Culture에 대한 보고서 자료입니다.

목차

1. 세포배양(Cell Culture)이란?
2. 세포배양에 필요한 기구
3. 배양용 배지 및 시약
4. 세포의 동결보존법
5. 세포의 해동법
6. 세포의 계대법

본문내용

신에 글리세롤을 첨가하는 일도 있지만 DMSO가 보다 효과적이다. 일반적인 동결배지의 조성은 20%혈청과 10%의 DMSO를 첨가한 기본 합성배지이다. 무혈청배양한 세포를 무혈청으로 동결보존하기 위해 만든 무혈청 배지가 있다.
동결배지를 포함하는 DMSO는 세포에 대해여 독성을 가지고 있기 때문에, 동결조작은 신속하게 해야 한다.
⑶ 동결 보존법의 실제
동결보존할 세포는 대수증식기에 있는 충분한 증식능력을 유지하고 원기를 가진 활성적인 세포를 사용해야 한다. 과증식하여 활성이 저하된 세포를 동결보존하면 생존율이 나쁘고, 동결 전후에서 세포집단이 변화할 위험성도 내포하고 있기에 이런 이유로 충분히 활성을 가진 세포를 증식해야 한다.
대수증식기에 있는 세포를 원심분리에 의해 대강 1-5 x 107개 정도를 모은다. 이것을 1-1.5mL의 냉각하여 놓은 동결배지에 현탁하고 동결보존용 튜브에 분주한다. 튜브에는 동결연월일, 세포의 이름, 실험자의 이름을 명기하고 캡의 부분을 비닐 테이프로 봉한다.
동결배지에 함유하고 있는 DMSO는 세포에 대하여 독성을 나타내므로, 세포를 현탁한 후 곧바로 딥 프리저에서 동결한다.
-80℃의 Deep Freezer에 의한 보존은 1-2년의 단기적인 보존을 이용, 그 이상의 장기보존에는 액체질소 보존통을 이용한다.
5. 세포의 해동법
세포 동결스톡의 해동은 동결의 경우와 똑같이 신속한 조작이 요구된다. 이유는 두 가지가 있는데, 하나는 저온에 의한 장해를 피하기 위해서이고, 또 하나는 DMSO에 의한 장해를 피하기 위해서이다. 때문에 세포의 동결스톡을 딥 프리저와 액체질소 보존통에서 꺼내기 전에 사전 준비가 필요하다.
먼저 무균실에 37-40℃정도의 급속해동용 욕조를 준비한다. 해동 후 세포를 세척하기 위해 15mL의 원심관에 배지를 적당량(10mL정도) 분주한다. 이들의 준비가 되면 동결 스톡을 딥 프리저 또는 액체질소 보존통에서 꺼낸다. (액체질소 보존통에서 보존하고 있던 경우, 동결튜브 안에 액체질소가 들어가 그것이 급격하게 기화하여 폭발하는 일이 일어날 수 있으므로 face guard 등을 준비할 필요가 있다.)
동결스톡을 꺼내어 바로 욕조에서 해동한다. 이때 동결뷰트를 흔들어주어 열이 균등하게 전해지도록 한다. 파스퇴르 피펫을 이용하여 동결튜브 내를 현탁 후 준비한 배지에 세포 현탁액을 넣고 세척, 원심 후 상청을 폐기하고 다시 한번 신선한 배지에 세포를 현탁하고 세척 조작을 한다. 다시 원심하여 세포를 회수하고 신선한 배지에 현탁하여 배양 용기에 분주한다.
6. 세포의 계대법
⑴정상세포
정상세포는 20-30회의 분열 후에 증식능력을 잃고 사멸하게 되는데, 이것을 프로그램 사, 또는 아폽토시스(apoptosis)라고 한다.
정상세포는 분열횟수가 증가함에 따라 노화하고, 세포의 성질이 시간경과에 따라 변하여 간다. 그렇기 때문에 세포의 계대수를 정화하게 파악하고, 세포의 계대수를 맞추어 행하지 않으면 재현성이 나타나지 않는 경우가 있다. 정상세포를 실험에 이용하려고 할 때는 먼저 대량으로 세포를 배양하고, 다수의 동결 스톡을 만들어서 정기적으로 세포를 배양하고, 다수의 동결 스톡을 만들어서 정기적으로 세포를 해동하여 일정한 계대를 거친 세포를 실험에 제공하는 것이 필요하다.
⑵수립세포주
일반적으로 암세포화한 세포주이고, 무한증식능력이 있다. 따라서 정상세포의 경우와 같이 계대수를 파악하려는 것은 무용하다고 생각된다. 배양세포는 돌연변이적으로 항상 변이를 집적하고 있고, 장기간 배양을 계속한 세포는 최초의 세포와 다른 경우가 많기 때문에 4-5개월마다 새로운 세포를 해동하여 사용할 필요가 있다.
세포밀도를 너무 낮추면 증식할 수 없는 세포가 생기고, 높은 세포밀도에서는 생존율이 저하하기 쉬우며 증식능력을 잃는 경우가 있다. 세포배양 때에 세포밀도를 극단적으로 낮추거나 증식정상기까지 증식시키려고 하면 변이세포가 선택적으로 증식하여 세포집단이 변화하는 결과를 가져올 수도 있기 때문에 늘 일정한 조건에서 계대를 하는 것이 중요하다.
⑶부유세포의 계대법
배지중에 부유한 상태에서 증식하는 세포이다. 계대법은 세포 현탁액을 신선한 배지에서 희석하여 접종하면 된다. 주의할 것은 과증식(over growth)이 되지 않도록 하는 것이다.
⑷접착세포의 계대법
증식에서 어떠한 담체에 접착하여야 하는 타입의 세포이다. 접착세포의 경우, 담체에 접착하지 않으면 증식하지 못하므로, 배양액에 대한 도달 세포밀도는 배양기의 표면적에 비하여 의존한다.

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